复肾口服液对阿霉素肾病大鼠肾脏形态的影响

                  作者：张淑萍   靳国印 李旺 张晓丽 薄爱华

【摘要】  目的：观察复肾口服液对阿霉素肾病大鼠肾脏的形态学影响。方法：采用尾静脉一次性注射阿霉素（ADR）复制肾病综合征模型。用光学显微镜、显微镜观察肾小球毛细血管、上皮细胞、基底膜及肾小管的病理形态学改变。结果：复肾口服液能使阿霉素肾病大鼠蛋白尿显著降低，肾小管管腔内的蛋白管型明显减少，肾小球淤血及上皮细胞和基底膜的损伤程度明显减轻，肾小球上皮细胞足突融合明显改善。结论：复肾口服液可促进肾病大鼠肾小球上皮细胞的修复及滤过膜功能的恢复，但存在着量效依赖关系。

【关键词】  复肾口服液；肾病综合征;大鼠模型;形态学

　　肾病综合征（nephrotic syndrome,NS）是由多种病理损害所致的一组临床症候群，以大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症及明显的水肿为临床特征。复肾口服液具有温肾健脾、益气养阴，兼以活血通络的作用，临床用于肾病综合征有一定的疗效。为探索其作用机制，本研究采用阿霉素（adriamycin，ADR）诱导肾病综合征大鼠模型，观察复肾口服液对肾病大鼠肾组织的病理形态学的影响，为研究复肾口服液的疗效机制提供实验依据，并进一步为临床有效治疗肾病综合征提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  实验动物  健康雄性Wistar大鼠，体重220±18g，共28只（由北京实验动物繁殖中心提供）。

　　1.1.2  药物  复肾口服液：由黄芪、党参、破故纸、胡芦巴等12味中药组成，所用药物购自河北北方学院附属第一。将上述药物采用水煎醇沉法制备为每1ml药液含原生药2g的口服液，用10ml安瓿分装，加热灭菌封口备用。

　　1.1.3  主要试剂  盐酸阿霉素（adriamycin,ADR）：粉针剂，每安瓿10ml，中美合资山西普德药业有限公司，批号：000814。临用时用生理盐水配成2mg/ml的溶液。磺基水杨酸AR：成都化学试剂厂生产。

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物分组及给药  将大鼠随机分出7只作为正常对照组；将其余21只大鼠参照方法[1，2]，给大鼠一次性尾静脉注射阿霉素（7?5mg/kg体重）建立大鼠肾病模型，正常对照组注射等量的生理盐水，7d后造模大鼠尿蛋白定量＞1?5g/L、定性在++或以上者确定为肾病大鼠，将肾病大鼠按体重再随机分为三组，即模型组、复肾口服液大剂量治疗组（10ml/kg）和复肾口服液小剂量治疗组（5ml/kg）。正常对照组、模型组给10ml/kg生理盐水作为对照。每日灌胃一次，连续28d。

　　1.2.2  标本采集及处理  用自制代谢笼收集大鼠造模前、造模后第7天，给药后第7、14、21、28天24h尿液，测24h尿蛋白定量（磺基水杨酸法）；给药28d后断头处死动物，立即剖腹取肾脏称重，光镜标本迅速放入10%甲醇中充分固定，石蜡包埋后备检，透射电镜标本用生理盐水冲洗后迅速置入4%戊二醛液中放冰箱冷藏固定备检。

　　1.2.3  HE染色  大鼠肾组织标本经常规石蜡包埋后连续切片，制成4μm石蜡切片。同时行HE染色，在光镜下观察分析。

　　1.2.4  透射电镜标本处理  4%戊二醛固定，磷酸缓冲液清洗，1%锇酸固定，磷酸缓冲液清洗，丙酮脱水，浸泡包埋，超薄切片,日立H?7500透射电镜观察。

　　1.2.5  统计学分析  全部数据用SPSS11?0软件进行统计学处理，采用t检验，结果用（x±s）表示。

　　2  结果

　　2.1  各组实验大鼠24h尿蛋白定量情况(见表1)由表1可以看出，在造模前各组大鼠24h尿蛋白定量均低于1?5g/L，且各组间无显著性差异（P＞0?05）。模型组大鼠尿蛋白定量在造模后第7天即明显增加,并呈进行性升高,最高者可达81?25g/L。复肾口服液大、小剂量治疗组均可显著降低大鼠尿蛋白排出量，与模型组比较有显著性差异（P＜0?01，P＜0?05）。由此可见，该方有明显的减轻蛋白尿作用。
　　
　　表1  各组大鼠不同时期尿蛋白定量变化（略）

　　2.2  肾组织病理观察

　　2.2.1  肉眼观察  正常组大鼠肾脏呈红褐色，表面光滑，切面可见皮髓质界限清晰，未见皮质缺血。模型组大鼠肾脏由红褐色变为黄褐色，包膜紧张，水肿明显，肾脏系数明显高于正常对照组（P＜0?01）（见表2）。经给药治疗后，上述情况均明显改善，二个治疗组肾脏系数均略低于模型对照组，与正常对照组比较仍有差异（P＜0?05）（见表2）。

　　2.2.2  光镜观察  正常对照组大鼠肾小球、肾小管及间质均正常，结构清晰（图1）；模型组可见肾皮质灶性损伤（图2），如肾小球淤血，肾小管上皮细胞肿胀变性、坏死，胞核脱落，管腔内可见大量蛋白管型；大剂量组肾小球均正常，未见肾小球淤血，肾小管上皮细胞无明显变性，腔内蛋白管型明显减少（图3）；小剂量治疗组与模型组近似，仍可见灶性肾小球淤血，肾小管上皮细胞变性，腔内可见蛋白管型（图4）。

　　表2  各组大鼠肾脏系数的变化（略）

　　2.2.3  电镜观察  正常对照组肾小球滤过膜结构正常，内皮细胞为有孔形，足突及裂孔清晰可见，基底膜均匀一致，肾小管上皮细胞结构亦正常（图5）；模型组肾小球内皮细胞及上皮细胞显著肿胀变性，形成空泡，上皮细胞足突广泛融合、消失，基底膜灶性增厚（图6）；复肾口服液大剂量组肾小球内皮细胞及上皮细胞无明显变性，足突及裂孔较清晰，基底膜仍有厚薄不一的现象（图7）。复肾口服液小剂量治疗组与模型组近似（图8）。

　　3  讨论
　　
　　尿蛋白是肾小球疾病最常见表现，也可作为一个独立的致病因素参与肾病变过程。蛋白尿不仅是NS的主要临床表现，还是肾脏疾病进一步恶化的重要因素。目前大量体外研究表明，蛋白尿具有潜在的肾毒性,不仅能造成肾小球系膜细胞和上皮细胞的损害，也可引起肾小管和间质的病变[3]。因此在肾小球疾病的过程中，控制蛋白从尿中丢失，其意义不仅在于改善临床症状，还在于减轻其对肾小球及肾小管的损伤，从而延缓肾脏疾病的进展[4]。肾小球的滤过膜由毛细血管内皮细胞、基底膜和脏层上皮细胞共同构成,生理状态下，对滤过物质的分子大小具有选择性。白蛋白因为分子量很大（69000D），故几乎不能通过。当各种致病因素引起肾小球病变时，都会影响滤过膜的屏障作用，通透性增加，使大分子物质得以通过，从而导致以白蛋白为主的蛋白尿大量漏出。本实验模型组光镜下肾小球基本正常，透射电镜下可见肾小球内皮细胞及上皮细胞肿胀，内质网扩张，形成大空泡，足细胞突起增宽、融合，局部裂孔消失，基底膜灶性增厚。复肾口服液大剂量组肾小球内皮细胞及上皮细胞无明显变性，足突及裂孔清晰，基底膜仍有厚薄不一的现象。复肾口服液小剂量组与模型组近似，但程度较轻，个别足细胞突起明显。结果显示：复肾口服液能使阿霉素肾病大鼠蛋白尿显著降低，肾小管管腔内的蛋白管型明显减少，肾小球淤血及上皮细胞和基底膜的损伤程度明显减轻，肾小球上皮细胞足突融合明显改善。说明复肾口服液能够有效减少阿霉素肾病大鼠的尿蛋白，有助于肾小球滤过膜功能的恢复，对肾小球滤过屏障的损伤具有保护作用，其机制可能是促进了上皮细胞的再生与修复。复肾口服液对肾病大鼠肾小球滤过膜的修复作用是治疗肾病综合征、控制蛋白尿的机理之一，而且治疗作用存在量效关系。方中以黄芪、党参为主补气固本，摄精止泄；破故纸、胡芦巴、菟丝子温补肾阳；地黄、山萸、山药味厚质重滋补肾阴；山药、白术相配健脾利湿，消肿；以蝉蜕、白僵蚕搜剔入络之邪，化瘀通络，以石苇利尿排毒。药理研究认为，黄芪味甘，微温，归脾、肺经，有补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水消肿之功。黄芪中含有大量多糖、氨基酸等增强机体免疫能力，促进细胞生长和再生，其水煎液提取成分黄芪F7、黄芪F4对小鼠肾细胞培养有明显的保护作用[5]。白术味苦甘温，入脾胃经，补气健脾，燥湿利水,有持久的利尿作用，且促进电解质特别是钠的排泄，其利尿作用可能是抑制肾小管重吸收所致[6]；另据报道白术对老年小鼠肾脏结构（肾小体数量、大小、滤过屏障、基底膜厚度及足细胞裂孔等）均有明显改善作用。全方诸药相伍，共奏温肾健脾、益气养阴，活血通络之功。

【】
  　　1 Bertani T,Poggi A.Adriamycin?induced nephrotic syndrome in rats sequence of pathologicevents/[J/].Lab Invest,1982,46:16

　　2 赵军宁，温志坚，王晓东，等.阿霉素肾病模型的实验研究及药物观察/[J/].药理通迅，1992，9（4）：28?31

　　3 程叙扬，李晓枚，唐嘉薇，等.微小病变患者尿蛋白对肾小管上皮细胞损伤作用及其机制研究/[J/].中华肾脏病杂志，2002，18（6）：398

　　4 张芬芳，王喜栋，陈志强，等.柴苓归芪汤加蚓激酶对实验性肾病综合征大鼠肾功能的保护作用/[J/].中西医结合学报，2005，3（4）：294?298

　　5 沈映军主编.中药药/[M/].第1版.北京：人民卫生出版社，2000.880?883

　　6 关小玲，张霞，陈欣欣.蛋白消合剂对肾病综合征大鼠SOD、MDA和-OH影响的实验研究/[J/].河南中医学院学报，2006，21（2）：24?28