溶藻细菌及其测定评价方法的研究进展

                  作者：赵传鹏，浦跃朴，尹立红

［摘要］ 溶藻细菌作为防治有害藻类水华的可能微生物，越来越引起了人们的关注。作者对溶藻细菌的种类、溶藻机理以及其测定与评价方法的研究进展进行综述。
    
　　［关键词］ 溶藻细菌;溶藻机理;测定方法;
    
　　溶藻细菌（algicidal bacteria）是一类以直接或间接方式抑制藻类生长，或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌的统称。部分相关研究提示水华和赤潮的突然消亡可能就与溶藻细菌有关。作为水体藻污染生物防治的可能途径，溶藻细菌的分离和利用已引起众多关注。作者着重对溶藻细菌及其测定评价方法近年来的研究进展进行综述。
    
　　1 溶藻细菌的种类
    
　　有关溶藻细菌报道最早的是黏细菌属（Myxobact-er）。1924年，Geitler报道了一种寄生在刚毛藻上、可使之死亡的黏细菌［1］ ;Shilo用几种从水塘中分离出来的黏细菌做溶藻试验，测试的10种蓝藻中有8种被溶解。Daft从废水中分离出9种黏细菌，可溶解鱼腥藻、束丝藻、微囊藻以及多种颤藻［2，3］ 。李勤生和黎尚豪也报道了黏细菌同蓝藻细胞相互接触，导致藻细胞溶解［4］ 。假单胞菌属（Pseudomonas）也是研究较多的一种溶藻细菌。1978年，Bakerk发现假单胞菌T827.2B分泌一种高分子质量的热稳定化合物能够杀灭硅藻［5］ 。Shinsaku则发现施氏假单胞菌可释放一些高活性溶藻物质，能够选择性地杀死绿胞藻;Dakhama报道了铜绿假单胞菌产生一些低分子质量的抗生素类物质，可以强烈溶解某些蓝藻和绿藻［6］ 。Takenaka等［7］ 在日本湖泊中分离出铜绿假单胞菌，其分泌的绿脓杆菌素以及碱性蛋白酶，可能是溶解微囊藻的主要物质。作者从太湖梅梁湾水域放置的除藻中试反应器的人工介质上分离出一株溶藻细菌，结合形态学、生、生物化学特性以及16srRNA特异性引物扩增综合分析，初步鉴定该株细菌属于假单胞菌属。该菌在太湖水中对微囊藻24h藻细胞溶解率为85.9%，完全溶藻时间为48h，对微囊藻毒素LR（ML-LR）也具有较强的降解作用。其溶藻方式可能为分泌某种胞外物质所致。
   
　　近年来，国内外中陆续有一些其他溶藻细菌的相关报道，主要有:从日本海域和韩国海域分离出的具有溶藻效应的黄杆菌属［8，9］ ，在海水中分离出的噬胞菌属［10，11］ 、能够杀死硅藻的交替假单胞菌［12，13］ 和鞘氨醇单胞菌属［14］ ，从武汉市池塘和东湖水域分离出的分别属于葡萄球菌属、芽孢杆菌属、节杆菌属以及欧文菌的溶藻菌［15，16］ ，袁峻峰等［17］ 发现中性柠檬酸菌对几种常见藻类生长也有一定的抑制作用。另外，具有溶藻作用的还有纤维弧菌属［18］ 、交替单胞菌［19，20］ 以及蛭弧菌属、弧菌、屈挠细菌属、产气单胞菌、腐生螺旋体属等［8］ 。综上所述，众多细菌被发现具有不同程度的溶藻作用，为微生物溶藻工程的实施打下了良好的基础。但在真正用于天然水环境的治理工程之前，该类菌的安全性评价以及驯化、载体、富集、机理及其效果评价等一系列问题还有待于进一步的研究。 

　　2 溶藻方式及机理
    
　　溶藻菌对藻细胞作用的方式和可能机理主要有以下5种:直接接触溶藻、释放杀藻物质、细菌与藻竞争营养物、形成菌胶膜及进入藻细胞内杀灭藻细胞。

　　2.1 直接接触溶藻
    
　　一些溶藻菌直接与藻细胞接触，通过释放可溶解纤维素的酶而消化藻细胞的细胞壁，进而逐渐溶解整个藻细胞。如前所述的黏细菌对蓝藻、鱼腥藻、束丝藻、微囊藻以及多种颤藻的溶解作用［2～4］ ;噬胞菌属（J18.M01）和腐生螺旋体属（SS98.5）能够特异性地与横裂甲藻和硅藻接触溶解藻细胞［21，22］ 等菌属直接接触溶藻。
    
　　2.2 释放杀藻物质
    
　　细菌可以通过释放特异性或非特异性的胞外物质杀死藻细胞，目前报道的细菌杀藻物质主要有蛋白质、多肽类物质以及抗生素。这类细菌常见的有弧菌、假单胞菌、黄杆菌、交替单胞菌、假交替单胞菌等。
    
　　2.2.1 蛋白质与多肽类物质  Lee从海水中分离的一株交替假单胞菌A28能杀死骨条藻。将A28的上清液经超滤所获得的浓缩上清液显示出杀藻活性，这表明A28能产生细胞外大分子物质杀藻，经分析该大分子物质为一种胞外丝氨酸蛋白酶［12］ 。一种被囊交替假单胞菌（D2）能够分泌一种分子质量为190kD的毒性蛋白ΔlpP，该蛋白也具有杀藻活性［23］ 。在日本湖泊中分离出铜绿假单胞菌，其分泌的绿脓杆菌素以及碱性蛋白酶，可能是溶解微囊藻的主要物质［7］ 。
   
　　从具有强烈杀藻活性的芽孢杆菌的SY.1菌株中分离出一种新的溶藻物质Bacillamide，通过二维NMR技术分析出其结构为一种多肽，它对多环旋沟藻有特异性的杀灭作用，半数致死量（LC50）为3.2μg・ml -1 。对由多环旋沟藻引起的有害水华有明显的抑制作用［24］ 。Banin报道一株珊瑚褪色弧菌能合成并分泌一种称为毒素P的胞外多肽，该毒素能够抑制与珊瑚共生的虫黄藻的光合作用，导致虫黄藻死亡［25］ 。
   
　　Yoshikawa从海水中分离、筛选出具有抗蓝藻活性的细菌。在2594株分离出的细菌中，有37株能产生抗颤藻的物质。其中一株C979经鉴定为弧菌属，其产生的具有杀藻作用的生物活性物质为强亲水性化合物β.氰基L丙氨酸［8］ 。
    
　　2.2.2 抗生素  铜绿假单胞菌可产生大量的抗生素类物质，如扩散性吩嗪色素类物质，这些物质对其他细菌和藻类都有抑制作用。最近有人从这种细菌当中提取了几种特异性杀藻的抗生素类物质，其中有些物质如1.羟基吩嗪和氧氯菌素能够强烈抑制蓝藻和绿藻的生长［6］ 。Kawano等从柄细菌属的PK654菌株中分离出一种抗生素thiotropocin，此抗生素对赤潮中的中骨条藻和赤潮异湾藻有明显的抑制作用［26］ 。
    
　　2.2.3 其它  施氏假单胞菌能释放高活性抑藻的化学物质，具有选择性杀伤生物的特殊性质。例如将这些细菌同绿胞藻以及黄尾鱼一起培养，藻被杀死，而黄尾鱼未受到任何影响［27］ 。

　　2.3 细菌与藻竞争营养物
    
　　有些细菌可通过C、N、P、K等物质与藻类产生直接或间接的联系。如芽孢杆菌的生长需要氮磷等物质的营养支持，从而会使水体中的氮磷含量下降，进而使水体无法满足微囊藻的生长需要。同时芽孢杆菌还可以微囊藻藻体作为C源加以利用;另外部分真菌和放线菌也会同藻类抢夺有限的营养物质，抑制藻类的生长［28］ 。
    
　　2.4 形成菌胶膜
    
　　如腐败菌、亚硝酸菌、大肠杆菌、枯草杆菌等大量出现时，单细胞藻类培养物会产生沉淀而颜色变黄，同时发生化学变化而发出氨臭味;另一方面，可在静止的水面集结形成菌胶膜，有碍气体交换和光线的透射，导致水环境恶化，致使藻类死亡。

　　2.5 进入藻细胞内杀死藻细胞
    
　　这种溶藻方式极其少见，有人从水华铜绿微囊藻中分离出一种类似蛭弧菌的细菌，这种细菌能够进入铜绿微囊藻的细胞并使藻细胞溶解［29］ 。

    
　　3 溶藻菌的测定及溶藻效果评价
    
　　3.1 溶藻菌的测定
    
　　常规用于微生物检验的生理生化方法由于较难检测与判断细菌在空间与时间上的分布，又由于溶藻细菌在水体中含量较低，故该类方法不适宜对环境中溶藻菌进行测定。目前的溶藻菌在天然水环境中时间与空间分布的检验方法主要集中在分子生物学技术方面。
    
　　3.1.1 实时定量PCR法  采用实时定量PCR技术（real-time quantitative PCR）可定量检测目标溶藻菌如铜绿假单胞菌、芽孢杆菌、交替假单胞菌等的含量与分布。其原理为运用该细菌属的特异性引物，快速检测出目标细菌DNA模板在总DNA模板中的比例，进而推算出目标细菌在样本中的丰度［30］ 。
    
　　3.1.2 PCR.变性梯度凝胶电泳法  采用PCR.变性梯 度凝胶电泳技术（PCR-denaturing gradient gel-electro-phoresis，PCR-DGGE）测定时，不用对细菌进行富集培养，可根据条带的多少以及明亮程度来判断细菌的多样性以及优势菌群，能够较为准确客观地反映实际环境样本中的细菌时空分布情况［31］ 。
    
　　3.1.3 荧光原位杂交法  荧光原位杂交法（fluorescent in situ hybridization，FISH）快速便捷，不仅可以定性，而且可以对环境中的细菌进行直接计数，为研究细菌类群的空间分布和数量分布提供了有效的检测工具。但该法要求环境样品中的待测细菌有较高的浓度，并且对于罕见的核酸序列，荧光探针造价较高［32］。

　　3.2 溶藻效果评价
    
　　对于溶藻菌溶藻效果的评价，目前主要的指标有:固体培养溶藻试验中检测溶藻斑的大小，液体溶藻试验中检测藻类数目和藻细胞形态的改变、叶绿素含量的变化以及加菌前后藻种丙二醛含量的变化等［33］ 。利用溶藻细菌治理水华，可使水环境保持生态平衡，从而达到防止赤潮的目的。但在以菌治藻的工程实施之前还有大量的研究工作要开展，例如:溶藻菌的驯化、安全性评价和在天然水体中的适应性研究，溶藻菌载体、富集方式的研究，杀藻作用与细菌种属特异性的关系，细菌的投放量、投放时间以及水体的营养程度的影响研究等。我国在溶藻细菌方面的工作基本处于实验室阶段，需要藻类学、细菌学、环境卫生学以及环境与工程学、材料学等方面的研究人员加强合作，共同努力，为水华、赤潮的生态治理提供有效的技术与手段。 

　　［参考］
     
　　［1］赵以军，刘永定.有害藻类及其微生物防治的基础―――藻菌关系的研究动态［J］.水生生物学报，1996，20（2）:173.181.
   
　　［2］CHRISTOPHER G P，TOM L D，HOAGLAND K D，et al.Infec-tion，growth，and community level consequences of a diatom patho-gen in a Sonoran Desert stream［J］.J Phycol，1993，29（4）:442.452.
   
　　［3］连玉武，王艳丽，郑天凌.赤潮科学中藻菌关系研究的若干问题［J］.海洋科学，1999（1）:35.38.
   
　　［4］李勤生，黎尚豪.溶解固氮蓝藻的细菌［J］.水生生物学集刊，1981，7（3）:377.384.
   
　　［5］BAKER K H，HERSON D S.Interactions between the diatom Thallasiosira Pseudonana and an associated Pseudomonad in a mariculture system［J］.Appl Environ Microbiol，1978，35（6）:791.796.
   
　　［6］DAKHAMA A，NOUE J，LAVOIE M C.Isolation and identifica-tion of anti-algal substances produced by Pseudomonas aeruginosa［J］.J Appl Phycol，1993，5（9）:297.306.
   
　　［7］TAKENAKA S，WATANABE M F.Microcystin LR degradation by Pseudomonas aeruginosa alkaline protease［J］.Chemosphere，1997，34（4）:749.757.
   
　　［8］YOSHIKAWA K，ADACHI K，NISHIJIMA M，et al.β-Cyanoala-nine production by marine bacteria on cyanide-free medium and its specific inhibitory activity toward cyanobacter［J］.Appl Environ Microbiol，2000，66（2）:718.722.
   
　　［9］SOHN J H，LEE J H，YI H，et al，Kordia algicida gen.nov.，sp.nov.，an algicidal bacterium isolated from red tide［J］.Int J Syst Evol Microbiol，2004，54（Pt3），675.680.
   
　　［10］MITSUTANI A，TAKESUE K，KIRITA M，et al.Lysis of Skele-tonema costatum by Cytophaga sp，isolated from the coastal water of the Ariake sea［J］.Nippon Suisan Gakkaishi，1992，58（2）:2158.2167.
   
　　［11］IMAI I，ISHIDA Y，HATA Y.Killing of marine phytoplankton by algiding bacterium Cytophaga sp，isolated from the coastal sea of Japan［J］.Mar Biol，1993，116（2）:527.532.
   
　　［12］LEE S O，KATO J，TAKIGUCHI N，et al.Involvement of an ex-tracellular protease in Algicidal activity of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp.strain A28［J］.Appl Environ Microbiol，2000，66（1）:4334.4339.
   
　　［13］LOVEJOY C，BOWMAN J P，HALLEGRAEFF GM.Algicidal ef-fects of a novel marine Pseudoalteromonas isolate（class Pro-teobacteria，gamma subdivision）on harmful algal bloom species of the genera Chattonella，Gymnodinum，and Heterosigma［J］.Ap-pl Environ Microbiol，1998，64（8）:2806.2813.
   
　　［14］IMAMURA N，MOTOIKE I，SHIMADA N，et al.An efficient screening approach for anti-Microcystis compounds based on knowledge of aquatic microbial ecosystem［J］.J Antibiotics，2001，54（7）:582.587.
   
　　［15］彭超，吴刚，席宇，等.3株溶藻细菌的分离鉴定及其溶藻效应［J］.环境科学研究，2003，16（1）:37.56.
   
　　［16］席宇，吴刚，张勇，等.一株淡水溶藻细菌的分离及初步研究［J］.华中师范大学学报（自然科学版），2003，37（2）:222.226.
   
　　［17］袁峻峰，孟智芳，陈德辉，等.中性柠檬酸菌对几种常见藻类生长的他感作用［J］.淡水渔业，1999，29（4）:12.15.
   
　　［18］SKERRATT J H，BOWMAN J P，HALLEGRAEFF G M，et al.Al-gicidal bacteria associated with blooms of a toxic dinoflagellatein a temperate Australian estuary［J］.Mar Ecol Prog Ser，2002，244:1.15.
   
　　［19］KIM J H，PARK J H，SONG Y H，et al.Isolation and character-ization of the marine bacterium，Alteromonas sp.SR-14inhibiting the growth of diatom Chaetoceros species［J］.J Korean Fish Soc， 1999，32:155.159.
   
　　［20］YOSHINAGA I，KIMM C，KATANOZAKA N，et al.Population structure of algicidal marine bacteria targeting the red tide-forming alga Heterosigma akashiwo（Raphidophyceae），determined by re-striction fragment length polymorphism analysis of the bacterial16S ribosomal RNA genes［J］.Mar Ecol Prog Ser，1998，170:33.44.

　　［21］IMAI I，ISHIDA Y，SAWAYAMA S，et al.Isolation of a marine gliding bacterium that kills Chattonella antiqua（Raphidophyceae）［J］.Nippon Suisan Gakkaishi，1991，57:1409.
   
　　［22］FURUSAWA G，YOSHIKAWA T，YASUDA A，et al.Algicidal activity and gliding motility of Saprospira sp.SS98-5［J］.Can J Microbiol，2003，49:92.100.
   
　　［23］ANNE M P，FLAVIA E，DORALYN D S，et al.Biofilm develop-ment and cell death in the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicate［J］.Appl Environ Microbiol，2004，7（70）:3232.3238.
　　［24］JEONG S Y，ISHIDA K，ITO Y，et al.Bacillamide，a novel algi-cide from the marine bacterium，Bacillus sp.SY-1，against the harmful dinoflagellate，Cochlodinium polykrikoides［J］.Tetrahe-dron Letters，2003，44:8005.8007.
   
　　［25］BANIN E，KHARE S K，NAIDER F，et al.Proline-rich peptide from the coral pathogen Vibrio shiloi that inhibits photosynthesis of zooxanthellae［J］.Appl Environ Microbiol，2001，67（4）:1536.1541.
   
　　［26］KAWANO Y，NAGAWA Y，NAKANISHI H，et al.Production of thiotropocin by a marine bacterium，Caulobacter sp.and its anti-microalgal activities［J］.J Mar Biotechnol，1997，5:225.229.
   
　　［27］HAYASHIDA S，TANAKA S，TERAMOTO Y，et al.Isolation of anti-algal Pseudomonas stutzeri strains and their lethal activity of Chattonella antigua［J］.Agric Biol Chem，1991，55（3）:787.790.

　　［28］瞿建宏，刘韶斌.水体中芽孢杆菌和微囊藻的生长及其资源竞争［J］.湛江海洋大学学报，2002，22（3）:13.18.
   
　　［29］张勇，席宇，吴刚.溶藻细菌杀藻物质的研究进展［J］.微生物学通报，2004，31（1）:127.131.
   
　　［30］SKOVHUS T L，RAMSING N B，HOLMSTROM C，et al.Real-time quantitative PCR for assessment of abundance of Pseudoalter-omonas species in marine samples［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70（4）:2373.2382.
   
　　［31］NICOLAISEN MH，RAMSINGN B.Denaturing gradient gel elec-trophoresis（DGGE）approaches to study the diversity of ammonia-oxidizing bacteria［J］.J Microbiol Methods，2002，50（2）:189.203.
   
　　［32］GILLAN D C，DUBILIER N.Novel epibiotic Thiothrix bacterium on a marine amphipod［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70（6）:3772.3775.
   
　　［33］史顺玉，刘永定，沈银武.细菌溶藻的初步研究［J］.水生生物学报，2004，28（2）:219.221.