低温下血小板生理学性质的研究进展
［关键词］ 低温;保存;血小板;生理学;
目前，许多血液病都需要在患者体内输入血小板来达到目的，但是，血小板保存技术的不足，使之不能适应临床需求。如:液态4℃低温保存的血小板容易被激活，输入体内后很快被清出血流，使其止血功能明显下降。而22℃常温振荡保存易使血小板遭受细菌污染，污染几率是低温保存的50倍，输入体内后会造成机体脓毒性休克，并且储存时间仅限于5d。深低温保存及低温干燥保存虽然可以克服上述缺点，但血小板深低温保存的保护剂二甲基亚砜（DMSO）对受者有毒副作用，在洗涤去除DMSO的过程中，血小板易被激活、损伤，丧失临床应用价值。低温干燥保存会导致血小板膜发生侧向分离、聚集，从而使血小板容易被激活［1］ 。近年来，随着对低温诱导血小板活化及低温保存的血小板在体内清除机制研究的不断深入，血小板4℃液态保存技术取得了突破性进展。研究表明，血小板低温保存后易被活化及在体内被快速清除的主要原因是血小板的生理学性质发生了改变，主要包括以下几方面。
1 钙离子及肌动蛋白上调
血小板对温度十分敏感，当它们置于低温下时，形态会从正常的铁饼状变成圆球状，周边形成许多伪足，同时伴有血小板胞质内的钙离子明显增加、微管解聚。Oliver等［2］ 将温度以0.5℃・min -1 的速度从20℃降至5℃，以钙敏感性荧光探针（Indo.1）探测人体血小板内钙浓度的变化，发现随着温度逐渐降低，血小板内钙离子明显增加，多数钙来源于微管中钙的释放。鬼笔环肽（phalloidin）可以与肌动蛋白结合，Tablin等［1］ 用荧光标记的鬼笔环肽探测肌动蛋白，发现血小板4℃低温保存1h后，肌动蛋白增加5倍以上。此外，血小板4℃低温保存24h以上会出现α.颗粒的聚集和释放，类似于血小板正常生理激活过程，之后血小板几乎失去活性。研究证明，低温下血小板形态的改变是由胞质内钙离子迅速增加，使血小板骨架肌动蛋白集结装配所造成的，血小板形态发生变化后易被激活。Reid等［3］ 发现，在血小板中加入钙离子螯合剂EGTA及细胞松弛素B后低温保存，血小板形态始终保持正常的铁饼状。
2 血小板膜侧向分离
Tablin等［1］ 发现，低温下血小板膜发生脂相转移及脂质成分侧向分离，这与胞质内钙离子迅速增加及骨架肌动蛋白的集结装配有关。膜脂质成分发生侧向分离可形成许多小的集团，这些集团由一些排列整齐的膜蛋白组成。研究者将这些小的集团分离出来后发现，其中包含有血小板凝血酶蛋白受体CD36及非受体类酪氨酸激酶类src、lyn、fyn，表明这些集团在细胞信号通路中起着一定作用，并且通常是使血小板激活的信号通路，在没有凝血酶存在的情况下可使血小板发生异常激活［1，4，5］ 。
从地球两极鱼类体内提取的抗冻糖蛋白是一种血小板低温保存的保护剂，它可使血小板低温保存21d以上。抗冻糖蛋白是通过抑制血小板膜侧向分离来达到保护目的的。其缺点是将血小板输入患者体内前，需充分洗涤去除抗冻糖蛋白，这一过程易造成血小板损伤，使其失去临床应用价值，并且抗冻糖蛋白不易获得，也限制了它的临床应用。海藻糖是一种非还原性双糖，不仅可以防止低温所致的血小板侧向分离，还对生物大分子具有干燥保护作用，是一种很有潜力的血小板低温保存保护剂［1］ 。
3 GPIbα的簇状聚集
有学者发现，低温保存的血小板回输体内后能够被肝脏巨噬细胞所吞噬，从而很快被清除出血流，最初认为是由低温造成的血小板形状改变所致。但Hoffmeister等［6］ 发现，在血小板中加入钙离子螯合剂EGTA及细胞松弛素B后，尽管能够使血小板保持正常的铁饼状，但血小板仍被快速清出血流［7］ ，于是研究者们推断是其他原因造成了血小板快速清除、寿命缩短。
血小板粘附受体GPIb.IX.V由GPIbα、GPIbβ、GPIX和GPV4种跨膜亚单位构成，它们的结合比例为2∶2∶2∶1。GPIbα胞外氨基末端区域为配体结合部位，胞内区域与肌丝蛋白A、B结合，肌丝蛋白又与肌动蛋白结合。正常情况下，血小板与vWF结合是通过GPIb.IX.V的亚单位GPIbα与vWF的A1区域相互作用，而肝脏巨噬细胞表面的α M β 2 （Mac.1）也同样具有A1区域，并且同样可以与GPIbα结合，因此，Simon等［8］ 推测，血小板低温保存体内快速清除可能与肝脏巨噬细胞表面的α M β 2 与GPIbα结合有关。Hoffmeister等［7］ 发现，α M β 2 缺陷的小鼠体内低温保存血小板清除率与常温相同，而将血小板表面的GPIbα去除后，也同样阻止了血小板的快速清除，并且，血小板在低温条件下，膜上GPIbα会发生簇状聚集，使肝脏巨噬细胞表面α M β 2 识别血小板.vWF受体复合物［（GPⅠbαβⅠX） 2 Ⅴ］，并将之吞噬，导致血小板的快速清除。Hoffmeister等［9］ 研究发现，β.N.乙酰葡萄糖氨基残基（β.GLcNAC）可抑制α M β 2 与GPIbα结合，从而证实α M β 2 的识别位点为GPⅠbαN链聚糖的β.GLcNAC。正常情况下，血小板膜上的GPIbα排列很稀疏，α M β 2 不能识别β.GLcNAC，而当血小板低温保存后，GPIbα呈簇状聚集，排列变得紧密，致使β.GLcNAC可被α M β 2 识别结合。
有学者设想［9］ ，如果将α M β 2 与β.GLcNAC这一结合位点封闭，则可以有效阻止血小板被肝巨噬细胞吞噬，延长低温保存后血小板在体内的循环时间。而研究者们发现，尿嘧啶二磷酸半乳糖（UDP.Gal）可以封闭 β.GLcNAC，从而延长血小板寿命，机制为:血小板中加 入UDP.Gal后，血小板半乳糖转移酶可有效地使β.GL-cNAC半乳糖化，从而封闭巨噬细胞表面α M β 2 的识别位点，保护血小板不被肝脏清除。
4 血小板内代谢活性增强致乳酸增加及pH下降
血小板4℃低温储存后会出谢活性增强致乳酸增加及pH下降，从而造成血小板损伤及活化。如果维持胞内高水平cAMP，可抑制乳酸增加及pH下降。因此，在低温保存的血小板中加入cAMP活化剂可以延长血小板的储存期。目前研究最多的一种cAMP活化剂为thrombosol。Rivera等［10］ 在血小板中加入thrombosol后放4℃储存，分别在第1、5、9天时观察血小板数量、代谢及完整性指标（pH、PO 2 、PCO 2 、LDH、葡萄糖、乳酸、重碳酸盐、MPV）、膜糖蛋白（GPⅡb.Ⅲa、GPⅠbα、CD63、CD62P）的表达、聚集功能（瑞斯托酶素、凝血酶为诱导剂）以及第二信使（cAMP、TXB2）水平的变化，结果表明，thrombosol对4℃储存的血小板具有明显保护作用，储存9d后，血小板存活率仍能维持80%以上，代谢及完整性指标、聚集功能均无明显改变，可见thrombosol能通过维持胞内高水平cAMP，有效阻止代谢活性增强，延长血小板储存期。
5 血小板膜磷酸酪氨酸磷酸酶（PTP）活性减弱
蛋白质酪氨酸磷酸化和去磷酸化的平衡在血小板止血功能中起重要作用，血小板4℃保存5d后，血小板膜磷酸酪氨酸磷酸酶（PTP）活性减弱，蛋白质的酪氨酸磷酸化增加，引起血小板止血功能的下降，维生素E可阻止血小板PTP活性的下降，有益于血小板的4℃保存［11］ 。
相信随着对低温保存下血小板易活化及在体内快速清除机制认识的不断深入，血小板4℃液态保存技术一定会有更进一步的，以满足临床对血小板的大量需求。
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