人脐血间充质干细胞分离培养及向成骨细胞分化的研究

               作者：农丕地，黄海玲，解继胜  

【摘要】  　　目的 拟建立一套较为简便、有效和实用的人脐血间充质干细胞（MSCs）体外分离培养体系，探讨其向成骨细胞分化的可行性。方法 由人脐静脉血获得MSCs，纯化培养后用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的培养液诱导，通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色检测诱导后细胞。结果 来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现形态学上可见间充质样的细胞，间充质样细胞为类似成纤维细胞样的细胞形态。诱导培养的细胞碱性磷酸酶染色呈阳性。结论 人脐血MSCs经合理的体外诱导培养后，可以分化为成骨细胞。

【关键词】  胎血 间质干细胞 成骨细胞 细胞分化 地塞米松 β-甘油磷酸钠

　　 Abstract:  Objective  To establish a more simple, effective and practical isolation and culture system for human umbilical cord blood (HUCB)-derived mesenchymal stem cells (MSCs), and investigate the feasibility of turning them into osteoblasts.  Methods  MSCs isolated from HUCB with Percoll density gradient solution were culture-expanded because the cells attached and grew on dishes, then MSCs were subcultured in a condition medium including dexamethasone, vitamin C and ?-glycerophosphate. An inverted microscope, immunocytochemical staining for alkaline phosphatase (ALP) were applied to observe the MSCs proliferation capability and osteogenic property.  Results  The HUCB-derived mononuclear cells, when placed in culture, gave rise to adherent cells, which exhibited either a fibroblast-like or mesenchymal-like phenotype. The MSCs in induced culture showed  immunocytochemical staining for ALP.  Conclusion  The HUCB-derived MSCs can be cultured and differentiated into osteoblasts in vitro.
  
　　Key words:  fetal blood; mesenchymal stem cells; osteoblasts; cell differentiation; dexamethasone;  ?-glycerophosphate

　　脐血(human umbilical cord blood,HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的干细胞和祖细胞。目前研究证实脐血中存在的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)在一定条件下进行体外培养和诱导分化后能成为神经细胞(神经元和神经胶质细胞)、心肌细胞、软骨细胞［1～4］，可作为细胞新的种子细胞和基因治疗新的载体细胞。随着组织工程学研究的深入，对于相关功能细胞研究逐渐扩展到干细胞领域，MSCs对骨组织修复有重要意义，本实验主要探索人脐血MSCs分离培养及分析其向成骨细胞分化的可行性。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料 

　　主要试剂和仪器：Dulbecco改良培养基(DMEM)，胎牛血清（HYCLONE公司）；β-甘油磷酸钠、地塞米松（美国SIGMA公司）；Percoll分离液(PHARMACIA公司)；碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（博士德公司）；其他试剂均为国产分析纯；CO2培养箱（SHELDONA公司）；AE31型倒置显微镜（MOTIC公司）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  脐血MSCs的分离培养 

　　从胎盘脐静脉穿刺抽取15ml脐血，肝素抗凝，加等量磷酸缓冲液稀释，取50ml离心管，先加入15ml密度1.077g/ml的Percoll梯度分离液，小心加入稀释后的脐血，2000r/min离心25min后，用吸管吸取分层界面的白色环形絮状物（富含单个核细胞），800r/min离心洗涤2次，5min/次，沉积细胞用含15％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的DMEM高糖培养基悬浮，调整细胞密度为1×109/L，接种于25T的培养瓶内，放置在37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养。孵育72h后更换培养基，去除红细胞及其他未贴壁细胞，以后视细胞生长情况平均三四天换液1次。

　　1.2.2  脐血MSCs的传代培养 

　　MSCs约于7周相互汇合达培养瓶底70％～80％的生长表面，此时进行传代培养。倒掉旧培养基，加入2ml 0.25％的胰酶消化，作用30s后弃掉大部分，留置少许于瓶中，适当用力振荡培养瓶，整瓶细胞放入培养箱中5min，在倒置显微镜下观察细胞解离程度，以细胞突起缩回、细胞间隙增大、细胞近乎圆形为度，加入含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化，用吸管轻柔吹打瓶底，收集细胞，800r/min离心洗涤2次，每次5min，接种于置有盖玻片的24孔培养板中。

　　1.2.3  MSCs诱导培养 

　　取第5～6代细胞按密度为5×104/ml接种于6孔培养板(孔内置无菌盖玻片)中，第2天换液，其中半数培养孔用诱导成骨培养液(5％FCS的DMEM含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠；10nmol/L地塞米松；50mg/L维生素C)进行培养，隔日换培养液1次，并观察细胞形态特征。

　　1.2.4  成骨细胞检测

　　1.2.4.1  形态学观察 

　　诱导后，每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况，特别注意其形态的改变，记录可见变化特征及其出现时间，拍照。

　　1.2.4.2  ALP染色 

　　诱导培养5～6天的细胞长满玻片时，取出玻片，用10%中性福尔马林溶液固定，按ALP试剂盒说明书行ALP免疫组化染色。对照染色，以正常羊血清替代一抗进行免疫组织化学染色。

　　2  结果

　　2.1  细胞形态学观察 

　　脐血间充质干细胞接种24h，仅见少量梭形贴壁细胞，近似圆形或短梭形，48h后贴壁细胞逐渐增多，细胞渐变长，3天后换液除去绝大部分悬浮细胞，可见分散的间充质干细胞小集落，集落细胞呈放射状生长。随着培养时间延长细胞集落逐渐增大，细胞形态呈长梭形，2周后细胞集落彼此融合，呈旋涡状或菊花状生长。传代后3周细胞基本融合成层（见图1）。MSCs经诱导培养后，细胞形态由长梭形渐变为多边形或立方形、三角形(见图2)。

　　2.2  ALP免疫组化染色 

　　可见胞浆中出现大量棕褐色颗粒（见图3）。对照染色细胞胞浆未见着色。

　　3  讨论

　　骨组织工程的种子细胞来源主要有成骨细胞和MSCs等。成骨细胞虽然具有良好的成骨活性，但来源有限，大量分离获取困难，体外大量扩增的潜力不足，故不能满足骨组织工程临床应用的需要；MSCs不仅具有良好的成骨细胞分化潜能和高成骨活性，而且具有强大的增殖潜能。目前，MSCs主要来源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能替代骨髓MSCs，并可弥补其缺陷的间充质干细胞来源，已越来越受到各国学者的关注。HUCB是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的干细胞，主要包含造血干细胞和MSCs。脐血中的MSCs可在体外培养，诱导分化后能成为神经细胞、心肌细胞［1～4］等。与骨髓相比，脐血有更充足的来源，脐带血中干细胞含量丰富，明显超过成人外周血含量，相当或超过成人骨髓中的含量［5］。由于MSCs具有多方向分化潜能，如何定向诱导其成骨分化是解决骨组织工程中种子细胞来源的一个前提。本实验采用Rosada等［6］描述的成骨诱导方法，即用地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠联合诱导。实验中我们发现，在传代的MSCs中加入诱导剂后，细胞逐渐增大，细胞形态由长梭形渐变为多边形或立方形、三角形，随着诱导时间的延长，细胞逐渐汇合呈铺路石状，形态向成骨细胞方向转化。ALP是成骨细胞分化成熟的重要标志，是参与骨组织形成、代谢及再生的重要物质，ALP能水解有机磷酸酶，使局部磷酸根浓度增高，而且可破坏钙化抑制剂，从而启动钙化，完成基质矿化过程，发挥在体外钙化过程中的关键性作用。本实验经成骨诱导培养后的MSCs，ALP染色为阳性，而相应对照组均为阴性。这证明用地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠联合诱导培养MSCs后具有成骨活性，即相当一部分MSCs经过诱导培养后已经诱导为成骨细胞，我们的研究结果与许多学者研究结果一致［6,7］。
   
　　本实验证实从人脐血中获取MSCs，在条件培养液诱导下，短期内可获得大量有成骨能力的细胞，该细胞具有明确的成骨生物学活性，是种子细胞的理想来源。

　　骨科临床上，创伤和骨病等引起的大段骨缺损的修复一直是个棘手的难题。最佳方法是自体骨移植，但对于大段骨缺损而言，存在取骨量有限和取骨处创伤的问题；而异体骨移植则有免疫排斥反应等缺陷，并有传播疾病的潜在风险。用组织工程学的方法构建人工骨是目前的研究热点。其基本思路是将具有成骨潜能的种子细胞结合到人工骨支架材料，在骨生长因子的作用下生成新骨用于临床。因此寻找合适的种子细胞，提高组织工程化人工骨的成骨效能具有重大意义。

【】
  　　［1］Hou L, Cao H, Wang D, et al. Induction of umbilical cord blood mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro ［J］. Int J Hematol,2003,78(3):256-261.

　　［2］候玲玲，曹华，魏国荣,等.人脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究［J］.中华血液杂志,2002，23（8）：415-419.

　　［3］Kadner A, Hoerstrup SP, Tracy J, et al. Human umbilical cord cells: a new cell source for cardiovascular tissue engineering ［J］. Ann Thorac Surg,2004,74(4):1422-1428.

　　［4］农丕地,解继胜,黄海玲.体外诱导人脐带血间充质干细胞为软骨细胞的初步研究［J］.右江民族医学院学报,2007,29(5):689-691.

　　［5］沈柏钧.人类脐血——基础与临床［M］.天津：天津技术出版社，2000:157-176.

　　［6］Rosada C, Jus tesen J, Melsvik D, et al. The human umbilical cord blood: a potential source for osteoblast progenitor cells ［J］. Calcif Tissue Int,2003,72(2):135-142.

　　［7］Goodwin HS, Bicknese AR, Chien SN, et al. Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat and neural markers ［J］. Biol Blood Marrow Transplant,2001,7(11):581-588.