基因治疗修复骨缺损的研究进展
【关键词】 基因/；骨/创伤和损伤；修复外科手术；组织工程；基因表达调控
基因治疗是骨缺损修复研究的热点之一。当前对基因治疗修复骨缺损的研究主要在骨诱导因子、目的基因、各种载体及靶细胞等方面，将目的基因通过体内或体外途径转移靶细胞，维持骨诱导因子在局部持续有效地表达，从而治疗修复骨缺损。笔者就基因治疗修复骨缺损的研究进展综述如下。
1 基因治疗背景
基因治疗是分子生物学技术发展的产物。基因治疗的概念是在20世纪80年代初期提出的，随后获得了飞快的发展。20世纪90年代初期，随着世界首例腺苷脱氧酶（ADA）缺乏性重症免疫缺陷病的治疗获得成功［1］，基因治疗获得了临床治疗的批准，进而推动了其他一些疾病的基因治疗的发展。早期的基因治疗是向靶细胞引入外源性基因，以补偿其基因缺陷，从而达到治疗目的。随着基因治疗技术的发展，基因治疗已不再局限于治疗遗传性基因缺陷性疾病，而是将外源基因导入目的细胞并有效表达，从而达到治疗目的。
创伤、肿瘤及人工关节翻修手术等各种因素均可造成骨缺损，其治疗修复一直是临床难题。骨缺损的传统治疗包括自体骨移植、异体骨和人工骨移植，每种方法均存在一定的局限性，难以完全满足临床需要。人们用移植物修复骨缺损和促进骨愈合时，希望移植物既有成骨传导（osteoconduction）作用，又有成骨诱导（osteoinduction）作用。在基因治疗中后者越来越显得重要。现已证明生长因子如BMP、TGF-P、PDGF等有促进骨修复的作用，只要在骨缺损的部位集聚合适的生长因子，就可以产生足够的成骨诱导应答。但是生长因子的表达往往是短暂的，只有通过转基因技术，用目的基因转染靶细胞，使之稳定长效地分泌生长因子，才可望达到预期的良好疗效。近年来，国内外已经开始使用基因治疗一些骨科疾病，并取得了一些阶段性成果，基因治疗修复骨缺损是目前进展最快的领域之一［2～25］。
2 基因治疗修复骨缺损的技术选择
基因治疗是将有促进骨愈合作用的基因转入靶细胞，由靶细胞转录成mRNA并翻译成蛋白质，在蛋白质的作用下靶细胞被刺激分化，通过自分泌或旁分泌的方式达到促进骨愈合，从而达到修复骨缺损的目的。随着细胞重组技术的不断发展，越来越多地参与骨修复生长因子的基因被成功克隆，使得基因治疗骨缺损成为一种可实现的理想。基因治疗具有的优点是：①基因产物可以局部和靶向释放；②可最大限度地增加局部治疗效果，减少全身副作用；③多种基因可分别转向，并分别调控，内源性合成的蛋白质比外源性重组蛋白质具有更强的生物活性等优点，因此基因治疗被认为是维持骨缺损局部生长因子有效治疗浓度最具有希望的一种方法［2，3］。
2.1 目的基因的选择 基因治疗修复骨缺损需要选择目的基因、靶细胞和基因载体，然后通过基因转移技术来实施修复治疗的目的。根据基因治疗的理论，凡是能促进骨折愈合和骨生长的基因均可作为骨缺损治疗修复的目的基因。这些目的基因主要有骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP），可溶性生长因子［如血小板源性生长因子（PDCF）、成纤维细胞生长因子（FCF）、胰岛素样生长因子（ICF）］，影响合成代谢的因子［如甲状旁腺激素（PTH）、甲状旁腺激素相关肽（PTHrP）］，影响血管生成因子［如血管内皮细胞生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FCF）］，影响骨相关基因表达的因子（Rune2/Cbfal、Osterix、Sox9、DLX2-6），细胞外基质中的受体和受体拮抗因子（如白细胞介素-1受体、BMP受体）及矿化蛋白-1（LM-1）等。这些基因表达的产物除矿化蛋白-1为细胞内因子外，其余均属于细胞外分泌型因子。BMP是骨生长修复的启动因子，它能诱导骨髓基质细胞分化为成骨细胞和骨细胞，促进钙化作用，产生钙化的骨基质完成修复过程。随着重组DNA技术的应用，已有十多种BMPcDAN被成功克隆。BMP是目前骨缺损基因治疗修复中应用研究最多的目的基因，已在兔、鼠、羊和犬模型中证实其对骨缺损的修复作用。有研究证明［4～7］BMP-2和BMP-7是BMP家族成员中作用最强的因子。
2.2 目的基因载体选择 基因治疗需要合适的载体，载体的作用在于避免载体的宿主细胞对外源性基因产物的排斥反应。理想的载体应满足以下条件：①有对特定靶细胞的选择性；②能传导分裂和非分裂的细胞；③有效地将目的基因整合入宿主细胞的DNA；④在调控好的治疗水平内提供短期或长期的基因表达；⑤高滴度制造目的基因；⑥成本合理适宜于应用治疗。基因表达载体有病毒表达载体和非病毒表达载体。目前这两种载体基本具备上述大部分条件。病毒表达载体种类很多，有RNA逆转录病毒、DNA腺病毒和DNA腺相关病毒（AAV）等；非病毒基因表达载体有脂质体、DNA质粒、DNA配体复合物、裸DNA和基因枪等。目前被研究应用最多的是腺病毒载体，已有多种腺病毒载体被用作研究基因的传递工具，包括重组腺病毒载体在内［8～10］。病毒载体能高滴度地生产目的基因，很容易转染分裂期和非分裂期细胞［11］；但其缺点在于病毒壳体蛋白在靶细胞表面，容易吸引免疫活性细胞如细胞毒性疾病引起免疫反应而成为在基因治疗非致死性疾病方面的最大障碍。Okuboy等［12］在将Ad-ＢＭＰ-2注射到兔腓肠肌内的术前1天使用环磷酰胺（125mg/kg）来抑制腺病毒壳体质蛋白的急性免疫反应，结果经短暂的免疫抑制后，Ad-BMP-2仍具有异位诱导成骨作用。非病毒载体虽然比病毒载体容易生产，操作简易安全，化学稳定性强，不会引起强烈的免疫应答，而且可以重复使用，但它们在体内转染的效能低，使其在研究应用上受到很大的制约。在基因治疗中，要根据体内或体外转导方式、蛋白功能预计持续时间，解剖部位和治疗条件来选择合适的载体。Kang等［2］和Hannallah等［13］分别就两种载体在骨科基因治疗领域的应用作过报道。
2.3 靶细胞的选择 靶细胞选择是关系到基因治疗是否成功的一个重要因素。基因治疗的靶细胞应具有取材容易、含量丰富，在体外容易培养，而且外源基因能高效导入并表达，细胞寿命长等条件。目前在伦理和上是不允许使用生殖细胞作为靶细胞进行基因治疗的。骨缺损修复部位的所有细胞理论上均可选为基因治疗的靶细胞，但选择时须考虑具体的解剖部位、骨骼和周围软组织的质量。对于诱导成骨的基因治疗，体外转导方式和技术实际上已决定了靶细胞。骨缺损基因治疗中应用的靶细胞主要有骨髓基质干细胞（bone marrow stem cells，BMSC）、骨骼肌细胞、成纤维细胞等。骨髓基质干细胞具有分化为成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞的潜能，它从体内收集后可以在细胞培养中扩增，再分离出来后用作诱导成骨和促进骨修复的基因治疗的靶细胞，其效果在动物实验研究已有证明［14～16］。BMSC不仅作用诱人，而且数量庞大，因为细胞培养时它能扩增近300倍，而且即使扩增超过10亿倍，仍未丢失它本身的潜能。BMSC不能分泌或旁分泌蛋白如BMP，而且能对这些蛋白产生应答，这种自分泌和旁分泌的应答更加能促进骨修复。Musgrave 等［１７］比较了骨髓基质干细胞、初级骨基质细胞、初级肌母细胞、初级软骨细胞和初级成纤维细胞等5种不同类型的细胞转导BMP-2基因后分泌该蛋白的能力，结果发现了这5种细胞能在体外成功分泌BMP-2，并在体内诱导异位成骨，其中骨BMSC能力最强，初级肌母细胞次之；同时检测了5种细胞内碱性磷酸酶（ACP）的活性，并以此来评价5种细胞对BMP-2的反应灵敏度，结果与上相同。因此，BMSC具有来源广泛，在体外培养体系中扩增迅速，并能长期稳定地表达多种载体介导的外源性目的基因等优势。所以BMSC作为一种基因治疗的靶细胞有许多优势，被研究应用最多，已经显示出广阔的前景［18～22］。
2.4 基因转移的方法 骨缺损的基因治疗中将外源性基因插入宿主或供体细胞，使它们具有分泌生长因子的细胞微泵功能，这就是基因转移技术。基因转移的方法有两种：体外转移技术（ex vivo）和体内转移技术（in vivo）。
体内基因转移是通过直接将含有目的基因的病毒表达载体或质粒注射到骨缺损局部。该技术简单易行，在手术室就可以操作，具有显著的应用优势。Musgrave［23］用体内转移技术将BMP-2腺病毒载体直接注射到裸鼠和正常鼠大腿肌肉，观察异位诱导成骨作用，结果术后2周均可见异位骨形成，X线和组织学观察见成熟的骨髓组织，但裸鼠异位成骨的数量明显多于正常鼠。Baltzer等［9］采用直接注射携带BMP-2基因的腺病毒的方法修复兔股骨干1.3cm骨缺损，通过放射学、组织学和生物力学等分析证实骨缺损得以修复；对照组骨缺损处大部分为纤维化，骨化稀疏不稳定。
体外转移技术是从组织中分离靶细胞，进行体外培养，将目的基因进行转染后重新植入局部。因为体外转基因没有将病毒颗粒或DNA复合物直接注射到体内，所以可以选择靶细胞，而且在技术上具有高效率的细胞转导。因此用腺病毒载体进行体外转基因比体内转基因安全，同时体外细胞的获取、感染、转导和植入合适的解剖部位所需的时间较短，操作也很简单，可根据实际需要复合人工骨材料后植入。但其缺点是方法复杂，需要收集靶细胞，费时且费用较高。徐小良等［24］用腺病毒介导的BMP-2基因转染兔骨髓充质干细胞修复兔桡骨缺损，BMP-2能在局部持续表达2～3周，并诱导本身和周围骨髓干细胞向成骨细胞分化成骨。金丹等报道［25］hBMP-7基因转染修复兔桡骨中段1.5cm骨缺损的研究证实了逆转录病毒的hBMP-7基因转染能提高BMSC构建组织工程化骨组织和修复骨缺损能力，经转染的BMSC不仅充当了骨组织工程的种子细胞，并且能够作为外源hBMP-7的释放载体进一步提高成骨效果。另外有学者［26，27］用明胶海绵作为质粒水泵载体将外源性生长因子较长时间停留在创伤部位，从而延长其基因表达时间，加快骨缺损修复作用。
3 多基因联合治疗修复骨缺损
目前对骨缺损的基因治疗研究多集中在单个目的基因应用方面，实际上，在骨愈合和骨生成过程中，有多个基因共同参与，并协同表达。近年来许多实验证明，多个基因的联合传递更能促进骨修复，如Musgrave 等［28］和Franceschi等［29］ 将分别携带BMP-2、4和7的腺病毒载体并转染细胞，测定细胞培养上清液中ALP的活性，结果发现，Ad-BMP-7联合时，细胞上清液中ALP的活性均较单基因应用时提高2～4倍，提示联合应用时成骨能力提高，但Ad-BMP-2与Ad-BMP-4联合时，与Ad-BMP-2单独应用无差异。
随着基因治疗技术的不断发展，新型基因载体的不断应用，今后会有越来越多的基因如BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMP-9、VEGF等联合转入相应的种子细胞，使基因治疗修复骨缺损的成骨能力进一步明显提高，同时也能为一些复杂的骨组织疾病或骨肿瘤的治疗提供新思路和新方法。
4 基因与组织工程结合修复骨缺损
骨修复是一个复杂的生物学过程，局部基因治疗能促进骨诱导，为临床加快骨愈合，治疗骨缺损提供更可行、有效、廉价而并发症少的新方法。目前的研究，一方面应用体内转移技术将含有目的基因的病毒载体或质粒注射到骨缺损局部进行治疗修复，另一方面应用体外转移技术从组织中分离靶细胞，与支架材料复合构建而成人工骨，即基因强化组织工程骨，再移植治疗修复骨缺损，这样既保持了移植物的成骨传导作用，又提供了基因治疗中的成骨诱导作用，从而保证了骨生长修复的效果。金丹等［25］用hBMP-7基因转染兔骨质细胞后，与左旋聚丙交酯（PLLA）复合培养，组建基因强化的组织工程骨修复兔桡骨中段1.5cm缺损。术后3周时，hBMP-7转染骨髓基质干细胞，BMSC+PLLA组和未转染BMSC+PLLA组骨缺损两端和缺损中心有密度增高影，提示有新骨生成，6周时新骨量增多，但转染组形成的新骨与正常兔桡骨相似，而未转染组形成的骨桥较薄，体积明显小于前者；单独PLLA组和对照组缺损两端只有少量骨组织形成，大部分被纤维结缔组织充满，骨缺损未修复。基因强化组织工程骨治疗修复骨缺损克服了基因治疗和组织工程骨单独治疗骨缺损的不足，是未来治疗修复骨缺损的方向。
5 问题与展望
骨缺损的治疗传统方法如自体骨、异体骨和人工骨移植，均存在一定的局限性，难以完全满足临床的需要。目前，基因治疗修复骨缺损的基础研究已取得了重大的进展，已成为基因治疗最有前途的领域之一，很快将进入临床研究阶段［30］。骨缺损的基因治疗修复研究还存在许多问题，如技术、费用、疗效、安全及伦理等。在今后的研究中，如何解决病毒载体的免疫反应，保证宿主不感染，如何增加非病毒载体的表达效率，选择何种受体细胞表达目的基因的效果最好，基因强化组织工程骨中开发应用等等问题，仍是研究的重点和难点。可以预见，随着对骨形成、骨修复和骨重建的生物学研究的深化，对基因转移的工具、技术及其基因治疗策略的优化以及基因强化组织工程骨的开发应用，骨缺损的治疗修复将出现一个革命性的进展，展现出广阔的前景。
【】
［1］ Anderson WF.Gene therapy of genetic disease (deitorid) ［J］.Hum Gene Ther，1994，5(3)：281-282.
［2］ Kang R，Chivizzani SG，Muzzonigro TS，et al.Orthopaedic applications of gene therapy.From concept to clinic ［J］.Clin Orthop Relat Res，2000，375(1)：324-337.
［3］ Franscesechi RT.Biological approaches to bone regeneration by gene therapy ［J］.J Dent Ret，2005，84(12)：1093-1103.
［4］ Rutherford RB，Moalli M，Francecchi RT，et al.Bone morphogenetic protein-transmuted human fibroblasts convert to osteoblasts and form bone in vivo ［J］.Tissue Eng，2002，8(3)：441-452.
［5］ Dumont RJ，Dayoub H，LiJ2，et al.Ex vivo bone morphogenetic protein-9 gene therapy using human mesenchymal stem cells induces spinal fusion in rodents ［J］.Neurosurgery，2002，51(5)：1239-1244.
［6］ Lee JY，Perg H，Usas A，et al. Enhancement of bone healing based on ex vivo genetherapy using human muscle-derived cells expressing bone morphogenetic protein 2 ［J］. Hum Gene Ther，2002，13(10)：1201-1211.
［7］ Reddi AH.Initiation of fracture repair by bone morphogenetic proteins ［J］.Clin Orthop Relat Res，1998，355(suppl)：S66-S72.
［8］ Chen Y，Cheung K，Kung RH，et al.In vivo new bone morphogenetic protein-4 gene ［J］.Biochen Biophys Res Commun，2002，298(1)：121-127.
［9］ Baltzer AW，Laffermann C，Whalen JD，et al.Potential role of direct adenoviral gene transfer in enhancing fracture repair ［J］.Clin Orthop，2000，379(1)：120-125.
［10］ Viggeswarapu M，Boden SD，Liu Y，et al.Adenoviral delivery of LIM mineralization protein-1 indeces new bone formation in vitro and in vivo ［J］.J Bone joint Surg(Am)，2001，83(3)：364-376.
［11］ Bao JJ，Zhang WW，Kuo MT.Adenoviral delivery of hepatocellular carcinomas ［J］.Hum Gene Ther，1996，7(3)：355-365.
［12］ Okuboy Y.Osteoinduction by bone morphogenetic protein-2 via adenoviral vector under transient immunosuppression ［J］.Biochem Biophys Commun，2000，267（1）：382-387.
［13］ Ｈannallah D，Peterson B，Lieberman JR，et al.Gene therapy in orthopeadic surgery ［J］.Instr Course Lect，2003，52(3)：753-768.
［14］ Werntz JR，Lane JM，Burstein AH，et al.Qualitative and quantitative analysis of orthotropic bone regeneration by marrow ［J］.J Orthop Res，1996，14(1)：85-93.
［15］ 于耀恺，戴克戎，张满，等.应用富集骨髓干细胞技术治疗骨缺损［J］.中华骨科杂志，2006，26（11）：721-727.
［16］ Hernigou P，Poignard A，Manicom O，et al.The use of percutaneous tautologies bone narrow transplantation in nonunion and vascular necrosis of bone ［J］.J Bone Surg (Br)，2005，87(7)：896-902.
［17］ Musgrave DS，Bosch P，Lee JY，et al.Ex vivo gene therapy to produce bone using different cell types ［J］.Clin Orthop Res，2000，378(9)：290-305.
［18］ Blum JS，Barry MA，Miros AG，et al.In vivo evaluation of gene therapy vector in ex vivo-derived marrow stromal cells for bone regeneration in a rat critical-sized calvarial defect model ［J］. Hum Gene Ther，2003，14(18)：1689-1701.
［19］ Nakashima m，Zohara K，Zheng L．Gene therapy for dentin regeneration with bone morphogenetic proteins ［J］.Curr Gene Ther，2006，6(5)：551-560.
［20］ Kirker-Head CA.Potential applications and delivery strategies for bone morphogenetic proteins ［J］.Adv Drug Deliv Rer，2000，43(1)：65-92.
［21］ 陈光兴，杨柳，唐康来，等.成骨诱导的骨髓基因干细胞成骨活性的表达与维持 ［J］.中华创伤骨科杂志，2004，6(7)：735-739.
［22］ 李军，范清宇，范德刚，等.骨形成蛋白-2基因在人骨髓基质细胞中的表达对成骨分化的作用 ［J］.中华骨科杂志，2004，6（4）：410-413.
［23］ Musgrave DS．Adenovirus-mediated direct gene therapy with morphogenetic protein-2 produces bone ［J］.Bone，1999，24(5)：541-547.
［24］ 徐小良，戴克戎，汤亭亭，等.腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因修复兔桡骨缺损［J］.中华骨科创伤杂志，2002，18（11）：677-680.
［25］ 金丹，裴国献，王珂，等.hBMP-7基因转染修复骨缺损的实验研究 ［J］．中华骨科杂志，2003，23（12）：747-751.
［26］ Geiger F，Bertram H，Berger I，et al.Vascular endothelial growth factor gene-activated matrix (VECF 165-GAM) enhances osteogenesis and angiogenesis in large segmental bone defects ［J］.J Bone Minter Res，2005，20(11)：2028-2035.
［27］ 赵冬梅，杨加峰，刘军莉，等.重组VECF16质粒对骨缺损修复的影响 ［J］.中华骨科杂志，2006，26（11）：769-772.
［28］ Musgrave DS，Fu FH，Huard J.Gene therapy and tissue engineering in orthopeadic surgery ［J］.J Am Acad Orthop Surg，2002，10(1)：6-15.
［29］ Franceschi RT.Yang S，Rutherford BB，et al.Gene therapy approaches for bone regeneration ［J］.Cells Tissues Organs，2004，176(1-3)：95-108.
［30］ Evans CH，Ghivizzani SC，Robbins PD. Orthopeadic gene therapy ［J］. Clin Orthop，2004，429(12)：316-329.
