促血管生成素-2在肿瘤早期筛查中的应用初探
【摘要】 目的：研究Ang-2在肿瘤患者与正常人血清中的表达水平，并探讨其在肿瘤诊断中的应用价值。方法：采用免疫比浊法检测74例肿瘤患者和30例正常人血清中Ang-2的表达水平。结果：肿瘤患者血清中Ang-2表达水平显著高于正常对照组（P＜0.05），肝癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌和胃肠肿瘤中阳性检出率分别为89.5%、66.0%、100.0%、100.0%、94.1%。结论：Ang-2可作为肿瘤早期筛查和诊断的指标。
【关键词】 促血管生成素-2；肿瘤；免疫比浊法
[Abstract] Objective: To investigate the relationship of the Ang-2 expression in serum between the tumor patients and normal persons, and evaluate its role in cancer diagnosing. Methods: The expressions of Ang-2 in serum of 74 tumor patients and 30 normal persons were examined by immunoturbidimetry. Results: Ang-2 in serum of the tumor patients was significantly higher than that in serum of normal person（P<0.05）. The positive rates in Ang-2 test of hepatic carcinoma, non-small cell lung carcinoma, ovarian carcinoma, prostate carcinoma and gastrointestinal tract carcinoma were 89.5%, 66.0%, 100%, 100% and 94.1% respectively. Conclusions: Ang-2 is a useful predictor for early screening and diagnosing carcinoma.
[Key words] Angiopoietin-2；Carcinoma；Immunoturbidimetry 促血管生成素( angiopoietin, Ang)是分泌型细胞因子，该细胞因子家族在血管重塑、胚胎血管发育、肿瘤等研究热点中起着重要作用。20世纪70年代，Folkman等[1]发现新的微血管形成是实体肿瘤形成、和转移过程中非常关键的一环，证明肿瘤细胞可以释放出一种调节因子用以促进新血管的形成和维持。1997年Maisonpierre等[2]用分子克隆技术证明了Ang-2的存在。Ang-2是新近发现的与肿瘤血管生成相关的内皮生长因子，且特异表达于肿瘤边缘的血管重建区[3，4]，参与肿瘤新生血管的形成、延续，影响肿瘤的生长、转移。国内对Ang-2的研究多为运用RT-PCR和S-P免疫组化方法检测Ang-2在肿瘤组织中血管的表达，未见有检测血清中Ang-2的相关报道。对2006年6月~2007年3月收治的74例肿瘤患者通过免疫比浊法，初步探讨Ang-2在肿瘤患者与正常人血清中表达的水平及其在肿瘤诊断中的应用价值。
1 材料和方法
1.1 临床资料 74例中肝癌19例，肺癌15例，卵巢癌9例，前列腺癌14例，胃肠肿瘤17例；男41例，年龄24~86岁，平均62.3岁；女33例，年龄29~78岁，平均55.1岁，均经病理诊断确诊。健康体检者为对照组30例中，男19例，女11例，年龄24~58岁，平均42.6岁。
1.2 试剂和仪器 Ang-2单克隆抗体(广东虹业抗体科技有限公司提供)，含缓冲液、处理液和单克隆抗体，均为液体试剂，直接使用。检测用仪器为北京普朗新技术有限公司生产的具有340 nm波长的DNM-9602A型酶标分析仪。
1.3 方法 （1）样本处理：取静脉血3～4 ml待凝固后立即离心分离血清，置-70℃保存待测；（2）检测方法：在48孔酶标板上设C1、C2、C3、C4 、C5为标准管，其浓度分别为0、8、16、32、64 U/ml，C6～D12为样本孔。取13 μl缓冲液和13 μl处理液加入酶标板孔，再加入样本或标准品20 μl，震荡混匀3～5 s，37℃反应20 min。然后再加入170 μl单克隆抗体应用液，震荡混匀3～5 s后，用340 nm波长在酶标仪上读取吸光度A1。然后再放37℃反应10 min，取出在30 s内，于340 nm波长在酶标仪上读取吸光度A2。以△A=A2~A1为横坐标，浓度为纵坐标作一标准曲线，各样本浓度。
1.4 统计学方法 结果均以■±s表示,采用SPSS 11.5 for Windows统计软件包处理实验数据,显著性水准设为α=0.05。配对资料采用t检验,组间资料用χ2检验。
2 结 果
2.1 Ang-2在不同肿瘤患者中的表达水平 见表1。74例肿瘤患者血清中Ang-2的表达水平均高于对照组（P＜0.05）。
2.2 Ang-2与其他肿瘤标志物的相关性 在肝癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌和胃肠道癌中，Ang-2以＞■±2s（＞12.5 U/ml）为阳性，分别与AFP（＞25 ng/ml为阳性）、CY21-1（＞5 ng/ml为阳性）、CA-125（＞35 ng/ml为阳性）、PSA（＞10 ng/ml为阳性）和CEA（＞10 ng/ml为阳性）相比较，其诊断阳性率见表2。
2.3 Ang-2在肿瘤诊断中的ROC曲线分析 分析30例正常对照组和74例肿瘤患者Ang-2浓度，用SPSS 11.5 for Windows统计软件进行处理，曲线下面积达0.949（见图1），说明Ang-2在肿瘤的筛查中有较好的应用价值。
3 讨 论
促血管生成素是迄今唯一基于其促血管新生能力而被发现和分离纯化的血管生成因子，促血管生成能力非常强。在生理浓度下Ang即对主动脉内皮细胞及平滑肌细胞，脐静脉、脐动脉的内皮细胞及平滑肌细胞表现出很强的促增殖作用。血管生成功能参与许多生理过程，如胚胎发育、伤口愈合、女性生理周期中子宫内膜的重建等。另一方面不正常的血管生成也是许多病理过程的关键步骤，如肿瘤形成、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病变、动脉粥样硬化等。特别是肿瘤的形成与转移更是依赖于新血管的形成，研究表明不同来源的肿瘤组织及肿瘤细胞系中均有Ang mRNA的表达。在肿瘤发生的不同阶段刺激新生血管的生成，且肿瘤患者血液中Ang水平的高低与肿瘤的恶性程度密切相关[2]。Etoh等[5]的研究发现Ang-2 可以通过诱导内皮细胞蛋白酶的产生促进肿瘤血管的形成及肿瘤生长转移。
本研究应用免疫比浊检测法探讨Ang-2在肿瘤患者早期诊断中的作用, 发现Ang-2 在肿瘤患者血清中的表达水平高于非肿瘤患者。在不同类型肿瘤中与其相应的传统检测指标相比，检出的阳性率有高有低。结果显示在肝癌中Ang-2的检出率高于AFP，但无统计学意义。Ang-2表达的增加可能与肿瘤组织中的血管化程度密切相关[6]。Ang-2在卵巢癌、前列腺癌和胃肠道癌中的阳性检出率高。李霞等[7]应用免疫组化技术对40 例大肠癌组织及其癌旁正常组织中Ang-2 蛋白表达情况进行了检测。结果表明Ang-2在大肠癌组织呈现过表达，与癌旁正常组织相比差异有高度统计学意义，与我们检测的血清中Ang-2增高的结果相一致。在非小细胞肺癌中的检出率相对较低，卵巢癌和前列腺癌检出率特高，这与我们研究的样本量较少可能有关，值得进一步探讨。从我们的观察结果来看，Ang-2适用于多种肿瘤的早期筛查。Ang-2 在肿瘤中的表达及其与肿瘤的侵袭、转移行为间的关系及与疗效的判断等有待于进一步研究。
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[1] Folkman J. Angiogenensis in cancer, vascular rhenmatoid and other disease [J]. Nat med, 1995, 1(1): 27-31.
[2] Maisopierre PC, Suri C, Jones PF, et al An-giopoietin-2, a nature antagonist for Tie2 that disrupt in vivo angiogenesis[J]. Science,1997,277(5322)∶55-60.
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[4] Zhang L, Yang N, Park JW, et al. Tumor-derived vascular endothelial growth factor up-regulates angiopoietin-2 in host endothelium and destabilizes host vasculature, supporting angiogenesis in ovarian cancer[J]. Cancer Res，2003，63(12):3403-3412.
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