多重标记免疫组化技术在消化道肿瘤研究中的应用
作者：鄂群，卫爱军，王艳煜，肖玉凤，陈怀生，钱铮，陈莉
【摘要】 目的：探讨消化道肿瘤病理标本切片三重标记免疫组化的方法。方法：采用非同源第一抗体Ki-67、Net-1和CD34，选用辣根过氧化物酶不同底物显色AEC和DAB，运用pH2.2甘氨酸-盐酸缓冲液作阻断剂，配合碱性磷酸酶检测系统作第一标记的方法分步进行免疫组化染色操作。结果：镜下观察在肿瘤组织中，Ki-67定位于细胞核呈蓝黑色，Net-1定位于细胞质呈棕黄色，CD34定位于血管内皮细胞。染色鲜艳，对比鲜明。结论：该法对于运用免疫组化方法研究原位显示3种抗原及其之间的关系具有一定的实用价值。
【关键词】 多重标记免疫组化；阻断剂；吐温-20 PBS；双重标记免疫组化试剂盒
多重标记免疫组化染色技术是根据特异性抗体与抗原具有高度特异性结合力的免疫学基本原理，以双重免疫组化染色技术为基础，在同一张组织切片上同时或先后标记3种以上的抗原，在原位显示不同抗原的毗邻关系及伴随状况的一种多重免疫组化染色法。本文探索了CD34、Net-1和Ki-67 3种抗原原位标记消化道肿瘤、胃癌和肝癌石蜡切片标本免疫组化的方法，为了解肿瘤组织及其细胞的细胞核、细胞质及其间质不同抗原出现、增加和消减或及其之间的分布提供了一种有效的技术手段[1]。
1 材料和方法
1.1 材料来源 胃癌80例标本取自江苏省南通市海门市人民和肝癌40例标本取自江苏省南通市肿瘤医院的存档蜡块标本，每例分别做Ki-67、Net-1、CD34免疫组化单染后，从中筛选出3种标记均为阳性的病例进一步做多重免疫组化染色。
1.2 主要试剂 （1）免疫组化双染试剂盒（Histostain -Dskit；CAT.NO:95-9999）为美国ZYMED公司产品；（2）二步法免疫组化检测盒(PowerVisionTM Two-Step Histostain Reagent；PV6002)、胰蛋白酶消化液（ZLI-9010）及免疫组化笔（ZLI-9305，PAPPen）和DAB显色剂（IL1-9032；Lot:41281194）均为北京中杉金桥生物技术有限公司的产品；（3）阻断剂，pH2.2甘氨酸-盐酸缓冲液；（4）pH6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；（5）含0.05％吐温-20的PBS；（6）底物显色剂为DAB、AEC和BCIP/NBT；（7）即用型CEARMOUNTTM封固剂。
1.3 染色方法 （1）石蜡切片，常规脱蜡至水；（2）将pH 6.0柠檬酸缓冲液加热至沸腾，加入切片15分钟；（3）流水冲洗3分钟，用吸水纸将组织周围擦干，免疫组化笔画圈；（4）流水冲洗3分钟，蒸馏水冲洗浸泡2分钟×2次，每张切片滴加50μl 3％ H2O2去离子水，37℃孵育15分钟，以消除内源性过氧化物酶活性；（5）流水冲洗3分钟，蒸馏水冲洗浸泡2分钟×2次，PBS冲洗浸泡2分钟×3次；（6）滴加胰蛋白酶消化液，37℃孵育10分钟；（7）流水冲洗3分钟，蒸馏水冲洗浸泡2分钟×2次；（8）PBS冲洗浸泡2分钟×3次，每张切片滴加50μl正常非免疫动物血清，37℃孵育15分钟，倾去血清，不洗；（9）每张切片滴加50μl第一重标记的第一抗体（小鼠抗Ki-67；1︰50），37℃孵育60分钟或4℃过夜；（10）0.05%吐温-20 PBS冲洗3次，每次3分钟，甩去PBS液，每张切片滴加50μl广谱生物素化第二抗体37℃孵育30分钟；（11）0.05%吐温-20 PBS冲洗3次，每次3分钟；甩去PBS液，每张切片滴加50μl链霉卵白素碱磷酶轭合物，37℃孵育30分钟；（12）0.05%吐温-20 PBS冲洗3次，每次3分钟；甩去PBS液，每张切片滴加50μl显色剂BCIP/NBT显色，显微镜下观察控制（肿瘤组织细胞核出现蓝黑色呈色反应为阳性）；（13）当显色反应强而背景染色弱或无时应中止反应；即用0.05%吐温-20 PBS冲洗3次，每次3分钟；甩去PBS液，每张切片滴加增强剂50μl，37℃孵育30分钟;（14）按步骤（8）操作后，加第二重标记的第一抗体（兔抗Net-1；1︰400），37℃孵育40分钟；（15）按步骤（10）和（11）依次操作；（16）0．05%吐温-20 PBS冲洗3次，每次3分钟；甩去PBS液，滴加DAB显色液，每张切片滴加显色液50μl显色，显微镜下观察控制染色；（17）0.05%吐温-20 PBS冲洗3次，每次2分钟；甩去PBS液，蒸馏水冲洗浸泡2分钟×2次；（18）滴加阻断剂1.5~2小时，解离双重标记免疫反应复合物[1]；蒸馏水冲洗浸泡2分钟×2次；（19）按步骤（8）操作后，加第三重标记的第一抗体（小鼠抗CD34；1︰100），37℃孵育60分钟；（20）0．05%吐温-20 PBS冲洗3次，每次3分钟；甩去PBS液，每张切片滴加50μl辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠多聚体(PowerVisionTMTwo-Step Histostain Reagent；PV6002)，37℃孵育30分钟；（21）0.05%吐温-20 PBS冲洗3次，每次3分钟，甩去PBS液，每张切片滴加50μl显色剂AEC显色，显微镜下观察控制染色，流水冲洗后酌情衬染苏木素；（22）0．05%吐温-20 PBS冲洗3次，每次3分钟，蒸馏水冲洗浸泡2分钟×2次，晾干，用CEARMOUNTTM封固剂封片。
2 结 果
在消化道肿瘤肝癌和胃癌组织中；Ki-67阳性定位于细胞核，呈蓝黑色；Net-1阳性定位于细胞浆，呈棕黄色。CD34阳性定位于血管壁内皮细胞，呈桃红色（见图1）。
3 讨 论
据报道net-1基因是细胞增殖相关蛋白[4]，具有显著上调癌形成和促进癌进展，并能促进肿瘤血管增生；Ki-67反映了肿瘤细胞群体增殖活性和分化及其预后；CD34的表达变化反映了肿瘤组织的转移状况及其患者的预后。但是，由于这是单一标记的方法进行综合所形成结论，存在一定的人为误差。而该实验可提示3种基因原位表达状况，为检验这3种基因表达及其与肿瘤分化和患者的预后等指标的客观性和准确性提供了一种新的实验手段。其次，双酶三重免疫组化染色是在同一张组织切片上先后显示3种抗原成分的一种技术方法，通过免疫组化技术将辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶的3种底物DAB、AEC和BCIP/NBT的不同呈色反应表达3种特异性抗原Net-1、CD34和Ki-67，有助于临床对免疫组化染色结果的组织定位、定性的经验和彩色机图像分析系统的运用，可更为客观地在原位观察、分析、判断和检测不同抗原间的毗邻关系及其伴随的组织状况。该法拓展了免疫组化染色方法的临床病理方面的应用，且有很强的实用性。
但是，由于该法与双标和单标记免疫组化方法相比，其操作步骤较多，抗原预处理多样，染色结果受抗原、抗体、抗原修复、抗体标记物及其检测试剂交叉反应等诸多因素的影响[2]。因此，在实验操作中应注意以下问题：（1）实验前应充分理解并掌握抗原及其抗体检测系统或检测试剂盒之间的关系，设计实验操作步骤，将有关试剂进行合理组合和配伍，如优化抗原修复方案、安排抗体表达顺序、定点配置阻断剂等，以达到充分显露抗原，防止标记抗原之间的相互交叉表达或同位重叠表达的目的。本实验Ki-67、Net-1和CD34分别表达于细胞核、细胞浆和细胞间质的血管内皮细胞，从组织细胞解剖学空间结构上避免了染色结果中特异性显色反应定位重叠导致观察发生误判及其鉴别困难的可能性。其次，在配伍3种第一抗体相应的抗原预处理方法时应兼顾3种抗原修复的修复要求，本实验采用pH6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液复合胰蛋白酶消化液的联合修复方案，在满足Ki-67抗原充分暴露需胰蛋白酶消化的同时，又有助于Net-1和CD34的暴露，结果，使3种抗原均有较满意的表达；（2）在应用免疫组化双染试剂盒进行双重标记完成后[3]，进行第三重标记前，pH2.2甘氨酸-盐酸缓冲液，用其对以前双重标记的抗原抗体复合物进行了酸解离洗脱处理，而这并不影响已完成的双重标记定位[1]。尽可能消除了双重标记复合物中的第一抗体（小鼠或兔等非同源一抗）与后继标记的抗体发生交叉反应。为尽量缩短简化整个实验步骤，第三重标记采用了免疫组化二步法直接放大抗原信号，又增强了染色效果；（3）使用高质量的抗体和不同酶标记的免疫组化染色放大系统，并选用色彩鲜明，着色牢固的显色剂。本实验采用“双酶三底物”显色检测系统使三重标记呈现3种不同的颜色。实验证明[3]碱性磷酸酶显色检测系统显色反应颜色深，后继显色不易将其覆盖，应为第一重标记显色反应首选。本实验第一抗原Ki-67的标记酶显色反应，以阳性细胞核强着色而以其它组织如细胞浆及细胞间质均无背景反应为度。这样使后继辣根过氧化物酶标记的信号放大系统DAB酶显色反应和AEC酶显色反应充分显露，避免了第一重标记染色反应过度的背景对后继多重标记染色的干扰。达到增强不同酶显色反应染色反差，降低背景干扰，提高染色质量的目的。（4）在复染和封片时，须注意AEC与辣根过氧化物酶显色反应的生成物是醇溶性的，不能用醇溶性的苏木素衬染和中性树胶封片。水溶性封固剂封固后，如长时间放置，切片中常会出现封片剂干涸、气泡增多或酶显色反应定位颜色弥散的现象，宜尽快拍照存档。
【文献】
[1] 张锦生，主编.组织化学原理及应用[M].第2版.上海：上海科学技术文献出版社，2004:108
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