神经再生素对糖尿病大鼠周围神经病变治疗作用研究

【摘要】  目的: 观察神经再生素对糖尿病大鼠周围神经病变的影响。方法: 采用链脲菌素(STZ)糖尿病(DM)大鼠模型。造模成功1个月后给予药物处理，每日腹腔注射1次，连续给药8周。测定各组大鼠坐骨神经电生理及超微结构改变。结果：经神经再生素后, 糖尿病大鼠坐骨神经传导速度明显增快,感觉潜伏期(SL)减小，波幅升高，超微结构亦有明显改善。结论：神经再生素可改善神经髓鞘功能，有效提高糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经的感觉神经传导速度。

【关键词】  糖尿病 周围神经病变 神经再生素 大鼠

    [Abstract]   Objective: To investigate the protective effects of NRF on peripheral neuropathy of diabetic rats.  Methods: To use the model rats suffering from diabetes induced by Streptozotocin. The sensory nerve conduction velocity, stage of latency(SL) and  amplitude of wave of sciatic nerve were determined with evoked electromyogram. The morphologic changes in diabetic neuropathy was observed with microscope and electro-microscope for 8 weeks. Results: It was shown that NRF was able to increase the sciatic nerve conduction velocity, reduce SL and increase wave amplitude significantly(P<0.05), and improve the morphologic changes in diabetic neuropathy effectively. Conclusion: NRF may have the beneficial effect on diabetic peripheral neuropathy. The results suggest that NRF is able to improve the nerve conduction velocity and improve the morphology of sciatic nerve of diabetic rats.

    [Key words]   Diabetes；Peripheral neuropathy；Nerve regeneration factor；Rat

    糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病最常见的慢性并发症之一，发生最早，其发生率高达25%~90%，其病因及发病机制尚未完全明了[1]，目前尚无有效的治疗手段和特效药物。已证实神经再生素(nerve regeneration factor, NRF)对体外细胞具有明显的促神经生长作用[2]，但对糖尿病神经病变是否有保护作用未见报道。本实验采用形态学分析和神经电生理检测的方法，观察了神经再生素对实验性糖尿病大鼠周围神经病变的防治作用。

    1   材料和方法

    1.1   材料

    1.1.1   动物   实验用健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，体重为200~250g，由南通大学实验动物中心提供。

    1.1.2   药物及试剂   神经再生素(专利申请号01108209.7，由南通大学神经研究所惠赠); 链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司生产); 甲钴胺注射液 (Mecobalamine Injection，商品名：弥可保) 由日本卫材株式会社生产，卫材（苏州）制药有限公司分装，批号：020463。

    1.2   方法

    1.2.1   糖尿病大鼠模型制备   SD大鼠禁食12h后按60mg/kg的剂量给予一次性腹腔注射STZ（溶于0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液中，浓度为2%，pH4.5，使用前临时配制）。72h后由尾静脉采血测定血糖，凡血糖值>16mmol/L者即造模成功，纳入实验。

    1.2.2   动物分组   将入选大鼠喂养3d后，按体重、血糖随机分为4组，即（1）模型组(DC)；（2）弥可宝治疗组(MC)；（3）神经再生素低剂量治疗组(NRF1)；（4）神经再生素高剂量治疗组(NRF2)；并以同期体重、鼠龄相匹配的正常大鼠12只作为正常对照组(NC)。在给造模动物注射STZ的同时，该组大鼠注射等容量的柠檬酸缓冲液，其余处理同造模组。

    1.2.3   给药方法   造模成功1个月后，弥可宝治疗组给予弥可宝每天45μg/kg，神经再生素低剂量治疗组给予神经再生素每天2.5mg/kg，神经再生素高剂量治疗组给予神经再生素每天10mg/kg，每日腹腔注射1次，模型组、正常对照组分别给予等体积无菌生理盐水腹腔注射，各组均连续给药8周。造模成功后，每2周检测大鼠体重、血糖各1次。

    1.2.4   主要检测指标   ⑴体重、血糖每两周检测1次；⑵坐骨神经的采集与形态学分析：给药8周末，各组随机抽取1只大鼠，采集坐骨神经，一份用于光镜观察，另一份切片染色，透射电镜观察并摄像；⑶神经电生理检测：给药8周末，将大鼠用20％乌拉坦麻醉，剖开股二头肌与半膜肌间的皮肤，并沿两肌之间进行钝性分离，暴露坐骨神经。测定坐骨神经的感觉潜伏期(SL)、感觉神经传导速度(SNCV)及波幅(Am)。感觉神经刺激电极位于大鼠外踝上方0.3cm处，记录电极位于坐骨神经近心端，测量两极间的距离。刺激量从较小开始，逐渐增加到超强刺激。每次间隔1分钟，重复电刺激共3次，取平均值，其传导速度。诱发动作电位波幅测量从波形的最高点到最低点。潜伏期测量从刺激伪迹开始至动作电位的起始部止。

    1.3   统计学方法   采用Stata7.0软件进行方差分析，结果用■±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

    2   结      果

    2.1   各组体重、血糖变化   见表1。各组与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)，表明治疗药物对糖尿病大鼠体重、血糖等一般症状无明显影响。

    2.2   形态学改变   （1）光镜下观察：与正常组相比，模型组和各治疗组神经纤维间隙扩大，偶见髓鞘结构肿胀，少量样本间质内轻微充血。各治疗组与模型组相比光镜下未见明显差异；（2）电镜下观察：正常组髓鞘板层结构清晰，轴突内线粒体结构完好，神经纤维排列规整。模型组髓鞘板层分离，变性融合，轴突内线粒体变性肿胀形成空泡状，嵴稀少，排列紊乱，轴突内神经纤维排列紊乱。而神经再生素治疗组能改善糖尿病大鼠坐骨神经的脱髓鞘、轴突内线粒体肿胀等病理改变。高剂量组治疗效果明显，与阳性对照药弥可保相似，接近正常水平；低剂量组对坐骨神经病变亦有改善，但效果不如高剂量组明显（图1~5）。

    2.3   神经电生理结果比较   见表2。治疗8周后，糖尿病模型组与正常对照组相比，SNCV明显减慢，SL明显增加，Am明显减小(P均<0.01)。与模型组相比，神经再生素高剂量治疗组SNCV明显提高，SL明显减小，Am明显升高，三者均接近正常水平，并与弥可保治疗组相似。神经再生素低剂量治疗组与模型组相比无统计学意义(P>0.05)。高、低剂量治疗组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，表明有一定的剂量相关性。

    3   讨      论

    目前研究认为，糖尿病可导致一系列周围神经系统病变，主要表现为节段性脱髓鞘及不同程度的轴突损害，临床主要以远端感觉神经病变和对称性运动神经病变症状为主[3]。我们参照[4，5]建立DPN大鼠模型，结果表明DPN大鼠血糖升高、体重下降、坐骨神经感觉传导速度减慢，且糖尿病状态可致大鼠坐骨神经髓鞘及轴突发生改变，与人类糖尿病周围神经病变类似[6]。这表明我们已成功建立了稳定的DPN大鼠模型。

    神经电生理的变化是评价神经损伤及修复最早、最敏感的客观指标，神经传导速度、潜伏期及波幅的测定有助于确定周围神经病变的性质、程度和范围，反映神经髓鞘功能的改变。其中神经传导速度的减慢是周围神经受损的重要标志，常提示周围神经有节段性脱髓鞘改变。我们通过对大鼠坐骨神经超微结构观察和电生理检测来评价神经再生素对周围神经病变的恢复作用，从而寻找新的治疗药物。

    神经再生素是从“神经生长液”中分离提取的组分，以往实验已证实对体外细胞具有明显的促神经生长作用，但神经再生素对DPN是否有保护作用尚未见报道。弥可保作为治疗糖尿病神经障碍及多发性神经炎等周围神经疾病的药物已在临床应用多年，它能明显改善糖尿病周围神经的神经传导速度[7]，促进髓鞘形成，改善患者疼痛、麻木等症状。本实验结果证实，神经再生素可使DPN大鼠坐骨神经感觉潜伏期、感觉神经传导速度及波幅得到不同程度的恢复，提示神经再生素对糖尿病大鼠坐骨神经病变有一定的疗效。大鼠坐骨神经的形态学观察也显示神经再生素能改善糖尿病大鼠坐骨神经的脱髓鞘、轴突内线粒体肿胀等病理改变。神经再生素高剂量治疗组效果明显，与阳性对照药弥可保相似，接近正常水平；低剂量组对坐骨神经病变亦有改善，但效果不如高剂量组明显。表明神经再生素对糖尿病周围神经病变有一定的治疗作用，其作用机制将在以后的实验中进一步阐明。

【文献】
  [1] Verrotti A, Giuva PT, Morgese G, et al. New trends in the etiopathogenesis of diabetic peripheral neuropathy[J]. J Child Neurol， 2001,16(6):389-394.

[2] 刘 梅，强 亮, 王林芳,等. 神经再生素对神经细胞生长影响的实验研究[J].南通医学院学报，2002，22（4）：357-359.

[3] Sima AA, Sugimoto K. Experimental diabetic neuropathy: an update[J].Diabetologia，1999，42(7):773-788.

[4] 梁晓春，张 宏，郭赛珊，等.筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经传导速度、醛糖还原酶及山梨醇浓度的影响[J].糖尿病杂志，2000,8（1）：37-39.

[5] 林甲宜，戴 伦，徐结桂.葛根素注射液治疗糖尿病周围神经病变的疗效观察[J].中国糖尿病杂志，2000， 8（5）:269-271.

[6] Yasihashi S,Kamijom A,Watanbe K． Reduced myelinated fiber size correlated wjth loss of axonal neurofilaments in peripheral nerve of chronically streptozocin diabetic rats[J].Am J Pathol，1990,136:1365-1369.

[7] 张蜀平，陆菊明，潘长玉. 弥可保对糖尿病周围神经病变治疗作用的实验研究[J]．中华内分泌代谢杂志，1998，14(2):133-137.