阿尔茨海默病模型建立及干预实验研究进展
【关键词】 阿尔茨海默病 模型 干预实验
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种与衰老相关，以认知功能下降为特征的渐进性脑退行性疾病。AD患者整个大脑弥散性萎缩并出现明显的病理组织学改变——老年斑和神经纤维缠结（neurofibrillary tangle, NFT），并伴神经元减少，其中以基底前脑核海马区胆碱能神经元最严重。神经元细胞外淀粉样蛋白（amyloid β-protein, Aβ）沉积形成老年斑。晚期Aβ沉积激活小胶质细胞和星形胶质细胞引发了炎性反应，活化的胶质细胞围绕在斑块周围。由于AD是多因素引起，涉及多种病理机制的多因异质性疾病，因此建立一种理想的AD模型困难重重，影响了AD的深入研究，本文就近年来国内外AD动物模型的建立及相关的干预实验作一综述。
1 衰老动物模型及相关干预实验
AD多发于老年人，衰老是AD肯定的危险因素。随着世界人口的老龄化，AD的患病率显著上升，已成为成人的第4位死因，于是出现了以衰老作为AD发病基础的动物模型。
1.1 衰老认知障碍动物模型 通过动物本身的自然衰老来获得的AD动物模型，包括老龄大鼠、小鼠及猴等。这类模型的认知障碍等神经系统改变是自然发生的，更贴近AD的真实病理生理改变[1]，但这些模型一般不出现AD的SP与NFT等特征，且易死亡。
1.2 快速老化小鼠(senescence accelerated mouse，SAM)模型[2] 通过对AKR/J自然变异小鼠进行近交延代培养得到一种自然快速老化小鼠，该家族诸多品系中的SAM P/8和SAM P/10表现出明显的学习记忆功能减退，处于一种低紧张、低恐怖的痴呆状态。
1.3 D-半乳糖诱导的大、小鼠亚急性衰老模型 给药后的动物中枢神经系统出现一系列退行性变化，如海马锥体细胞数量减少、皮质神经元蛋白质合成减少、脑组织中超氧化物歧化酶活性降低、丙二醛 含量升高，表现出学习记忆能力下降、认知障碍、行动迟缓、毛发稀疏等老化征象[3]，但此类模型同样也未出现NFT及老年斑样改变。
将中药蛇床子、知母、红景天等应用于老龄动物[4]可通过清除自由基、增强超氧化物歧化酶活性来阻抑脂褐素堆积，保护模型动物的脑细胞；老龄大鼠口服大豆异黄酮后，神经生长因子mRNA及脑原性神经营养因子mRNA在老龄鼠前脑皮质明显升高，动物认知能力提高，认为其主要通过植物雌激素受体途径改善了神经元的可塑性及再生能力[5]。
2 胆碱能损伤为基础的AD动物模型及相关干预实验
哺乳动物脑内基底前脑胆碱能神经元、海马和皮层及它们之间的通路是学习记忆功能的重要结构基础。AD病患者基底前脑胆碱能神经元大量损伤或死亡、突触前乙酰胆碱的合成、ChAT（胆碱乙酰转移酶）的活性及对胆碱的摄取能力都明显下降，这些变化的程度与患者认知功能损害的程度呈正相关[6]，因此人们通过各种方法来破坏动物大脑的胆碱能系统，促使其发生学习记忆障碍而达到制作AD动物模型的目的。
2.1 电损毁、外科损毁 参照动物脑立体定位图谱，用电灼伤的方法损毁Meynert基底核，外科手术切断海马穹隆伞。术后动物出现了学习和记忆功能障碍，但病理上未出现老年斑和NFT[7]。因此种方法损毁范围较大,一度没有良好的干预措施，近年来研究发现把神经生长因子、脑原性神经营养因子和人脑原性神经营养因子基因修饰的神经干细胞移植入损伤动物的侧脑室和内侧隔核，均可不同程度的保护胆碱能神经元，改善模型动物的学习记忆力[8]，这为干细胞技术应用于AD提供了良好前景。
2.2 化学损毁 将鹅膏蕈氨酸、喹啉酸、海仁酸注入大鼠Meynert基底核可建立AD模型[9]，此法可造成胆碱能神经元减少、皮质ChAT活性降低，但不破坏通过此区域的神经纤维，术后海马神经细胞明显减少、学习记忆能力下降。但AD神经递质缺乏是广泛性的，此类模型只模拟了胆碱能功能减退的特征，并未复制出其他递质功能减退的表征，且模型也同样未出现AD的典型病理改变—老年斑和NFT[10]，因此制模时仍需在应用药物种类、剂量、作用部位及时间等方面进一步观察。术后为动物针灸可增加大鼠由于造模而损伤、坏死的边缘系统胆碱能突触数目[11]；中药槲皮、人参、何首乌、灵芝等均可提高模型大鼠大脑皮质和海马结构区乙酰胆碱含量和ChAT活性，改善模型动物的学习记忆能力[12]。
3 以Aβ为基础的AD动物模型及相关干预实验
脑内Aβ由淀粉样蛋白前体物质(amyloid precursor protein，APP)经一系列酶的降解而来。APP是体内广泛存在的一类跨膜蛋白质，APP在体内有两种代谢途径：（1）经由β、γ-分泌酶催化，在712位残基附近断裂产生对细胞有毒性的Aβ[13]；（2）APP经α-分泌酶和γ-分泌酶催化产生可溶性的APPα（sAPPα）。值得注意的是α-分泌酶从Aβ分子内部进行分解，避免了完整Aβ序列的产生，且sAPPα对神经细胞可产生营养、保护作用[14]。而Aβ过度产生后沉积于脑内，引起钙稳态失调，激活胶质细胞释放大量炎症介质、氧自由基，最终导致广泛的神经元变性、凋亡、突触缺失[15]。故认为Aβ沉积是AD发病的中心环节,因此出现了多种以Aβ为基础的模型，同时也带来了新药物作用的靶点。
3.1 Aβ脑内注射模型 将Aβ注入大鼠脑室、Meynert核、双侧海马可建立AD模型，术后大鼠学习记忆明显减退，海马区ChAT活性广泛下降、胆碱能神经元凋亡、突触结构减少，并出现Aβ沉积及近似AD中NP的形成，沉积斑周围有大量活化的胶质细胞聚集包绕，出现免疫炎性反应[16]，这种建模方法较全面的模拟了AD的病理和行为的改变。
3.2 AD转基因动物模型 随着分子生物学方法及相关的进步，1991年人们研究发现APP基因的错义突变会导致常染色体显性遗传的家族性AD（FAD）的发生，这些突变发生在APP的Aβ编码区[17]。随后又发现与AD发病有关的其他3个基因，分别是14号、1号和19号染色体上的早老素1（prsenilin-1，PS1）基因、早老素2（PS2）基因和载脂蛋白E4（apolipoprotein E4，apoE4）基因[18]。因此人们借助转基因技术将与AD相关的人类突变基因转入动物中，并使外源性基因稳定遗传，改变动物遗传学性状来达到在动物体内模拟人类AD特征的目的。目前主要有APP和老年斑转基因小鼠、 Aβ和C100-4转基因小鼠（C100是β-分泌酶剪切APP的产物，能被γ-分泌酶所水解而产生C端的Aβ）、载脂蛋白E小鼠等。这些转基因小鼠不同程度出现了AD的特征性改变，包括老年斑、记忆力障碍及神经元损失和反应性胶质细胞增生，但NFT却未得到很好的表现。NFT主要成分是异常过度磷酸化的微管相关蛋白tau聚集而形成的双螺旋丝，到目前为止，在AD患者中并未发现在tau基因存在着异常改变，而最近在17号染色体连锁的伴有帕金森氏病的前额颞叶痴呆（FTDP-17）中却发现了具有致病的tau基因突变[19]。该病为17号染色体相联帕金森病额颞叶痴呆。将人类17号染色体连锁的伴有帕金森氏病的前额颞叶痴呆突变tau基因导入小鼠中，此种转基因模型出现了老年斑和tau的病理改变，特别是NFT的形成，在AD动物模型方面取得了巨大进步，为针对老年斑和NFT方面的新药筛选提供了良好的动物模型。
3.3 相关干预实验 （1）中药干预：野葛根可改善Aβ脑内注射模型大鼠的学习记忆能力，通过上调凋亡抑制基因Bcl-2的表达、下调促凋亡基因Bax的表达,对抗Aβ的神经毒性，减轻Aβ沉积所造成的神经元损伤[20]；具有抗氧化效力的姜黄用于转基因鼠，发现可降低Aβ的含量，老年斑减少约50%[21]。（2）抗炎、抗氧化干预：非甾体抗炎药、糖皮质激素、雌激素应用于Aβ注射模型和Aβ转基因模型均可抑制Aβ沉积所引发的胶质细胞的活化及炎症介质和氧自由基的释放，并减少了Aβ沉淀数量和面积[22、23]；低毒、生物活性高的海洋糖类物质可通过抑制炎症介质的产生、异常的细胞内tau蛋白磷酸化、胶质细胞的反应性增生以及抑制与ApoE相关的氧化应激和ApoE与Aβ的结合等途径发挥抗炎、抗氧化的作用，保护神经元[24]。（3）免疫干预：采用鼻腔黏膜给药法，用Aβ免疫PDAPP鼠可引起黏膜淋巴组织免疫应答，不仅通过免疫产生了抗体，还可通过细胞免疫产生抗炎细胞因子如：IL-4、IL-10、TGF 等，有效地减少脑内Aβ的沉积和相关炎性反应、小鼠认知能力得到改善、脑中老年斑数量及Aβ42肽的水平都明显低于未免疫小鼠[25]；AβN末端的EFRH序列是抗凝聚抗体的抗原决定簇，可调节Aβ原纤维的形成和分解，用表达Aβ肽的3-6位氨基酸序列EFRH表位的丝状噬菌体注入动物体内同样可产生抗Aβ聚集的抗体，此方法可不用有毒性的整个Aβ蛋白来进行免疫，安全性较好[26]；（4）α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶干预：应用β-分泌酶和γ-分泌酶的抑制剂可抑制Aβ产生，被认为是一个理想的作用靶点。其能降低脑组织、脑脊液和血浆内Aβ的浓度[27] 。由于α-分泌酶和β-分泌酶竞争同一作用底物APP，使用β-分泌酶和γ-分泌酶抑制剂的同时，上调α-分泌酶同样可降低Aβ的产生，减少Aβ沉积，并较前者更易穿透血脑屏障。近几年一类属于解聚素和金属蛋白酶(主要指ADAM10、ADAM17和ADAM9)分子被认为是α-分泌酶候选分子，这几种ADAM分子通过共同作用来保证α-分泌酶功能的完成[28]；一些具有清除自由基和抗氧化作用的物质，如银杏叶提取物也有上调α-分泌酶活性的作用[29]；（5）Aβ降解酶干预：上调Aβ降解酶或增加其活性，如neprilysin、纤溶酶和基质金属蛋白酶-9等可使转基因小鼠Aβ沉积减轻[30]，其干预效果可与Aβ免疫干预相媲美。
4 tau蛋白过度磷酸化模型及相关干预实验
研究表明AD患者脑中沉积的Aβ通过抑制细胞对葡萄糖的摄入和利用而引起神经细胞退化，导致患者记忆能力减退[31]。而在糖尿病和ApoE4携有者的AD高发人群中，也会出现神经细胞葡萄糖摄入率降低的现象，且用葡萄糖和胰岛素合并能明显改善AD患者的记忆能力[32、33]。基于此，近些年出现了tau蛋白AD样磷酸化模型，用一次性大剂量streptozotocin（STZ）腹腔注射或STZ合并高脂饮食诱发小鼠糖尿病或使小鼠禁食引起神经细胞对葡萄糖的摄入和利用降低，使神经细胞内tau蛋白的N-乙酰氨基葡萄糖糖基化水平降低，游离出潜在的磷酸化位点。tau蛋白更易磷酸化，过度磷酸化改变了tau蛋白的结构和构象，最终引起微管结构崩解，形成大量的NFT结构[34]。此类模型可通过控制血糖水平间接恢复小鼠记忆能力；使用胰岛素抑制剂来逆转O-GlcNAc糖基化水平的下调，从而减轻tau蛋白的过度磷酸化，减少NFT的形成。
5 铝中毒模型及相关干预实验
人们发现外界环境危险因素在AD发病中也占重要地位，因此建立了铝元素慢性中毒的AD动物模型，动物脑内出现Aβ和APP的异常表达，同时伴有学习记忆力的明显降低。其机制可能是铝能抑制蛋白磷酸酯酶2A和2B的活性，促使异常磷酸化的tau蛋白产生，继而导致NFT的形成、胆碱能神经元损伤，导致学习记忆功能减退。有人应用铝螯合剂进行干预实验，可减少铝的吸收及脑组织铝浓度，且耐受性较好。
良好的AD动物模型最终将使AD的研究进入一个崭新的时代，为AD的基础性药物干预实验研究提供了一个良好的平台。但是，现有各种AD模型都无法全面复制出AD的病理、生化及神经行为学等方面的全部特征变化，即使某个AD动物模型完全具备了人类AD的所有特征，但由于人和动物间存在着差异，通过该AD模型筛选的有效药物也未必对AD患者一定有效。因此还需要进一步研究，最终还要通过AD患者的临床试验予以确认。
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