环氧合酶-2在食管癌中表达及与血管生成关系

【摘要】  目的：研究食管癌中环氧合酶－2（COX-2）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达及其与肿瘤微血管密度（MVD）和组织病理特征之间的关系。方法：应用免疫组化和原位杂交的方法分别检测72例食管癌组织和邻近正常食管上皮中COX-2 mRNA、COX-2蛋白、VEGF蛋白和CD31的表达，以CD31作为MVD指标，分析COX-2、VEGF与肿瘤MVD值和组织病理特征之间的关系。结果：在食管癌组织和正常上皮组织中各因子表达率分别为：COX-2 mRNA（77.8％，9.7％）、COX-2蛋白（88.9％，11.1％）、VEGF蛋白（58.3％，18.1％）、MVD值（33.40±6.517，18.22±6.396）。COX-2和VEGF在食管癌组织中出现异常高表达并伴有MVD值增加，而且与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期呈正相关。结论：COX-2、VEGF在食管癌组织中表达增高并与血管生成关系密切，并且可能参与了肿瘤细胞的浸润和转移；COX-2、VEGF的表达可作为判断食管癌生物学行为的重要指标。

【关键词】  食管癌 环氧合酶－2 血管内皮生长因子 新生血管化

    Expression of COX-2 and VEGF in esophageal carcinomas and their relationships to angiogenesis

    XU Xiaofei, 1CAO Xingjian, 1LIU Yajie,et al      （Department of Nuclear Medicine, the Second Affiliated Hospital of  Nanjing Medical University, Nanjing 210011；1The Second Affiliated Hospital of of Nantong University）

    [Abstacts]   Objective: To investigate the expression of cyclooxygenase-2(COX-2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in  esophageal carcinoma (EC) and their relationships to angiogenesis and clinicopathologic features. Methods: Using in situ hybridization and immunohistochemical methods, we assessed the expression of COX-2 mRNA, COX-2 protein, VEGF protein and CD31 protein(as microvessel density,MVD) in 72 surgically resected specimens from paitents with EC and 72 normal contiguous esoghageal mucosa specimens. We compared the expression levels of COX-2, VEGF and CD31 between EC and normal mucosa, and the relationship amonyn the expression levels, MVD and histopathologic features were also explored. Results: The rates of COX-2 mRNA, COX-2 protein and VEGF protein expressions  were 9.7%, 11.1%, 18.1% in normal mucosa and 77.8%, 88.9%, 58.3% in EC respectively. MVD was 33.40±6.51 in EC and 18.22±6.396 in normal mucosa. The expressions of COX-2, VEGF and CD31 were higher in EC than those in normal mucosa. In EC, COX-2 overexpression was significantly associated with high MVD , and high COX-2 and VEGF expressions had a positive correlation with TNM classification, depth of tumour invasion and lymph node metastasis. Conclusions: COX-2 and VEGF were overexpressed in EC. They were closely related to angiogenesis, and might participate in tumonr invasion and metastasis. Overexpressions of COX-2 and VEGF could be used as biological marker for evaluating the behavior of EC.

    [Key words]   Esophageal neoplasm; Cyclooxygenase-2; Vascular endothelial growth factors; Angiogenesis

    环氧合酶是体内催化花生四烯酸合成前列腺素的重要酶类之一，其诱导型合酶即环氧合酶－2（cyclooxygenase-2，COX-2）在许多恶性肿瘤中呈高表达，大量研究证实它与肿瘤血管生成密切相关。在对食管癌研究中，我们应用原位杂交和免疫组化方法对正常食管上皮组织和食管癌组织中COX-2 mRNA、COX-2蛋白、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factors，VEGF）蛋白及微血管密度（MVD）同时进行了检测，并结合临床病理资料综合分析。

    1   资料与方法

    1.1   一般资料   72例食管癌标本取自2003年2月~2005年4月间南通大学第二附属胸外科手术，其中男54例，女18例，年龄36~80岁，平均60岁。中晚期癌61例，表浅癌11例；鳞癌67例，腺癌5例；肿瘤局限于黏膜层4例，黏膜下层9例，浸润至肌层28例，浸润全层31例；有淋巴结转移26例，无转移46例；TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期27例，Ⅲ期32例，Ⅳ期2例。72例正常食管上皮组织取自上述标本中距离肿瘤边缘5cm以上的食管上皮，并经过病理检查排除肿瘤累及。

    1.2   检测试剂   COX-2原位杂交检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），抗人CD31单克隆抗体（Dako公司），AEC显色试验盒（福州迈新公司）、抗人COX-2单克隆抗体（Cayman公司），抗VEGF单克隆抗体（Neomarkers公司），第二代免疫组化ElivisionTM plus广谱试剂盒（福州迈新公司）。

    1.3   操作步骤   新鲜标本经DEPC水处理后，甲醛固定，脱水，石蜡包埋，作厚度4μm的连续切片，脱蜡待测。COX-2 mRNA检测按照原位杂交试剂盒说明书操作，暴露mRNA片断、后固定、预杂交、杂交、AEC显色、封片观察；COX-2、VEGF和CD31蛋白检测按免疫组化SP法常规操作技术进行处理，DAB显色，苏木素复染，常规脱水，透明，封片。阳性对照用已知阳性切片，阴性对照用磷酸盐缓冲液替代一抗。

    1.4   结果判断   （1）阳性判断：COX-2 mRNA表达以细胞膜或胞浆内有棕红色细颗粒为阳性，COX-2蛋白和VEGF蛋白以细胞膜或胞浆内有棕黄色细颗粒为阳性，肿瘤细胞无阳性反应为阴性。高倍镜下（200×）对每张切片随机选择5个视野，计数视野中肿瘤细胞的总细胞数和阳性细胞数，阳性细胞数占总细胞数比例<1%为阴性(－)， 1%～10%为弱阳性(+)，11%～50%为中度阳性(++), > 50%为强阳性（+++），+～+++均视为阳性表达；（2）MVD计数：先在低倍镜（40×）下找出肿瘤组织中微血管最密集的部位，然后在高倍镜（200×）下观察，任何被抗CD31抗体染成棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇，有或无管腔，只要与邻近的微血管及其它结缔组织成分有明显区别，均作为一个微血管计数。管腔直径大于50μm(约8个红细胞直径)、带有较厚肌层及硬化区的血管不在计数范畴。每个标本计数5个高倍视野下的血管数目，每组MVD值以■±s表示。

    1.5   统计学方法   应用SPSS 11.0统计软件包进行统计分析，其中两组间COX-2和VEGF表达的比较采用χ2检验和确切概率法，MVD值组间比较采用t检验； COX-2、VEGF的表达与肿瘤病理特征之间相关分析应用等级相关，P<0.05为差异有统计学意义。

    2   结       果

    2.1   COX-2的表达   食管癌组和正常上皮组中COX-2、VEGF表达与MVD值见表1。肿瘤组织中COX-2 mRNA主要表达于细胞核膜与细胞浆中，棕红色或红色细颗粒状弥漫性分布(图1)；COX-2蛋白表达位置与mRNA位置相似，以细胞浆为主，呈散在棕黄色颗粒样分布（图2）。COX-2蛋白表达水平与肿瘤TNM分期、浸润深度和淋巴结转移呈正相关，见表2。食管鳞癌和腺癌中COX-2表达比较无统计学意义。

    2.2   VEGF的表达和MVD值   食管癌和正常上皮组织中VEGF的表达率分别为58.3％，18.1％，组间比较差异有统计学意义（P<0.01），VEGF主要表达于细胞膜和细胞浆,呈棕色或深黄色颗粒状分布。除肿瘤细胞外，肿瘤组织内血管内皮细胞和部分间质细胞内也可见VEGF表达，而肿瘤细胞染色较深；肿瘤细胞团边缘的细胞染色较深,而团块中心的癌细胞染色相对较淡（图3）。VEGF的表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移和浸润深度呈正相关，而与肿瘤大小和病理分化等级无明显相关性，见表2。

    正常食管鳞状上皮中血管分布稀疏而，管腔相对规整。而食管癌组织内MVD值明显增高（P<0.05），管腔大小不一，分布杂乱，在肿瘤侵润边缘相对较多。MVD值与病理特征之间的关系见表2。

    2.3   食管癌组织中COX-2与VEGF和MVD值的相关性   在癌组织中， COX-2与VEGF的表达呈正相关（r＝0.329，P<0.01），与MVD值之间也呈正相关（r＝0.429，P<0.01）；VEGF的表达与MVD值呈正相关（r＝0.577，P<0.01）。

    3   讨      论

    COX-2是一种诱导型环氧合酶，在体内催化花生四烯酸合成前列腺素，在正常生理状态下多数组织不表达，而在细胞因子、炎性介质、多种促癌因素、细菌内毒素等刺激因素作用下，它在局部组织中表达可迅速上调[1]。现有的研究表明COX-2在人类多种恶性肿瘤发生过程中发挥重要作用，特别是通过COX-2合成产物前列腺素介导的肿瘤血管生成是目前关注的重点[2]。

    食管癌是亚洲地区常见恶性肿瘤之一，尤以食管鳞癌多见。多项研究表明COX-2在食管腺癌中存在高表达[3]，使用非甾体类消炎药或COX-2特异性抑制剂可以抑制腺癌细胞的增殖和生长活性[4]，阻止食管炎大鼠模型由炎症、不典型增生发展到食管腺癌的过程[5]。但对于COX-2在食管鳞癌中的表达仍有争议，有研究发现COX-2在食管鳞癌中表达率较低6.7％[6]，而Zimmermann等报道食管鳞癌中COX-2的表达率达91％[7]，最近一项研究发现食管鳞癌COX-2表达率为77％,且其表达上调与食管鳞癌的发生、发展密切相关[8]。我们分别从mRNA和蛋白水平对比分析了食管癌和正常食管上皮组织中COX-2的表达水平。在癌组织中COX-2 mRNA和蛋白表达表达率分别为88.9％、77.8％，均显著高于正常组织。提示国内食管鳞癌和腺癌组织中都存在COX-2的高表达，同时COX-2 蛋白水平和mRNA水平同步变化支持COX-2高表达存在于转录阶段，而非转录后阶段，这对于进一步探讨肿瘤组织中COX-2高表达机制提供了线索。有研究认为COX-2基因启动子的单核苷酸多态性与食管癌易感性有关[9]，也提示COX-2表达增加可能发生在转录或转录前水平。

    本研究发现COX-2蛋白的高表达与肿瘤TNM分期，肿瘤浸润深度以及淋巴结转移密切相关，与Zimmermann等[7]研究结果相仿，提示COX-2高表达在肿瘤进展过程中发挥作用。而我们同时对VEGF蛋白和微血管密度检测发现VEGF和COX-2表达存在相同趋势，提示COX-2在肿瘤进展中的作用可能与VEGF介导的血管生成有关。Tsujii等[10]将转染COX-2基因的结肠癌细胞和人脐静脉内皮细胞联合培养后发现在结肠癌细胞高表达COX-2的同时,培养介质中VEGF、bFGF和TGF-β等促血管因子蛋白水平也明显上调，并能促进内皮细胞增殖、迁移、形成网状的内皮细胞索；而这一过程与前列腺素浓度高低有关，进而推测存在COX-2介导的血管生成途径。近年研究提出更多的依据支持COX-2表达增加与促血管因子和血管生成相关[11]。Soumaoro等[12]发现结肠癌中COX-2表达与VEGF-C和MVD密切相关；Perrone等[13]也认为COX-2表达增加与壶腹部肿瘤临床病理特征及血管生成有关。研究认为COX-2的催化产物前列腺素类物质在诱导肿瘤血管的生成中发挥了重要作用[2]。我们研究表明，在食管癌中同样存在COX-2高表达与VEGF表达和MVD正相关，提示COX-2促进肿瘤恶性表型过程中，VEGF介导的肿瘤血管生成途径发挥了重要作用。

【】
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