肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立
作者：杨国柱， 傅思莹， 黄冰， 单于， 肖东， 马芸， 邓新燕， 陈系古
【摘要】 【目的】 制备TRE-HCV-C转基因小鼠,为四环素调控系统的体内研究提供了反应部分的转基因小鼠，以便与本实验室同时建立的调控部分的小鼠共同作用，为进一步建立双转基因小鼠模型奠定基础,更为丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV－C）的发病机制的研究提供一个实用方便的模型。【方法】 重组构建含有目的基因HCV－C、TRE序列和SV40 polyA的转基因载体pTRE-HCV-C，以显微注射的方法将1.153 kb的转基因片段注入BALB/C母鼠的受精卵，出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性，再经Southern 杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定。用转基因阳性小鼠和整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的另一品系转基因小鼠杂交，得到子代F1小鼠，通过免疫组织化学来初步检测HCV－C在肝脏中特异性的可调控性的表达。【结果】 产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首建鼠，以及它的子代也带有此基因。与基因组上整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的转基因小鼠杂交后，得到子代F1小鼠，特定时间与DOX作用后，小鼠肝脏的免疫组织化学结果表明，TRE-HCV-C小鼠为丙型肝炎病毒核心蛋白的发病机制研究提供了一个良好的动物模型工具。【结论】 成功制备了HCV-C转基因小鼠，可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用，为进一步建立四环素调控系统调控下表达HCV-C基因双转基因小鼠模型奠定基础，也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。
【关键词】 HCV－C； 丙型肝炎病毒核心蛋白; 转基因小鼠模型； 四环素调控系统； 组织特异性表达
1992年，Gossen等[1]提出了一种可控的、高效的基因表达系统，称Tet-off基因表达系统。该系统主要由四环素调控激活因子（tetracycline-controlled transactivator, tTA）和四环素反应元件（tetracycline responsive element, TRE）组成。该系统可以使基因的表达随着四环素浓度的增加以一种剂量依赖性的方式逐渐关闭甚至为零。1995年，Gossen等[2]通过改变tTA的氨基酸顺序得到一四环素反式激活因子（reverse tetracycline-controlled transactivator, rtTA）,构建了Tet-on基因表达系统。该系统在没有四环素的情况下基因表达水平为零，而在四环素或其衍生物强力霉素(doxycycline ,Dox) 存在时，rtTA 即与TetO结合启动转录。目前越来越多的研究采用四环素调控系统，将其运用于动物模型从而实现某些基因的时空表达来研究此类基因的功能。C蛋白是丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)编码的一种重要的结构蛋白，越来越多的研究结果表明C蛋白与HCV感染所致肝细胞癌的发生有密切关系[3]，但由于HCV具有极强的宿主特异性，目前对HCV及C蛋白的机制和功能的研究仅仅限于细胞模型，缺乏合适的小动物模型严重阻碍了在动物整体水平上的研究[4]。因此本研究应用四环素调控系统构建了携带TRE-HCV-C的转基因小鼠，为实现丙肝核心蛋白在肝脏的时空特异性的表达提供了一个极为有利的模型。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 种鼠为性成熟的BALB/C鼠,结扎公鼠为性成熟的BALB/C鼠,供卵鼠为4～6周龄BALB/C鼠。假孕鼠为8周龄BALB/C鼠(均为中山大学药学院实验动物中心提供)。
1.1.2 工具酶与试剂 质粒pHCV-MA由日本Prof. Akio Nomoto馈赠， pTRE由美国阿肯色州医学研究中心范春阳博士馈赠。宿主菌E.coli JM-109由本实验室保存。限制性内切酶XhoⅠ,HindⅢ, EcoRⅠ, XbaⅠ（TaKaRa公司），质粒DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，PCR纯化试剂盒（QIAGEN公司），Taq酶，dNTP，T4DNA连接酶，Milli-Q超纯水（Gibco公司），蛋白酶K（TaKaRa公司），M2、M16、透明质酸酶（Sigma公司），North2 South Direct HRP Labeling and Detection Kit(PIERCE公司)。PCR引物(根据Genbank自行设计) 。孕马血清(pregnant mare serum,PMS)和人绒毛膜促性腺激素( human chorionic gonadotropin, HCG) 均购自天津市华孚生物制品公司。鼠源性抗HCV-C蛋白单抗购自CLONTECH公司。
1.2 转基因载体的构建
使用QIAquick Plasmid Extraction Kit 提取质粒pHCV-MA（内含目的片段HCV-C cDNA序列）作为模板（Template），根据2b型HCV全长cDNA序列[3](Genebank 登录号：AB030907)设计上下游引物P1和P2， PCR扩增HCV-C基因片段，目的片段长度为573 bp。P1 5′-GGCGAATTCATGAG CACAAATCCTAAACC-3′；P2 5′-GCTCTAGATGA AGACACTGGCACTGTAACG-3′。上游引物包含基因的起始密码和EcoRⅠ酶切位点，下游引物包含基因的终止密码和XbaⅠ酶切位点。
PCR产物及质粒载体pTRE分别进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切。酶切产物使用QIAquick Gel Extraction进行琼脂糖凝胶电泳回收纯化。纯化的双酶切质粒pTRE与PCR产物（C片段）进行连接。按Qiagen试剂盒说明进行质粒提取与回收。质粒pTRE-HCV-C用XhoⅠ和Hind Ⅲ 酶切,其片段长度为1.513 kb。QIAGEN胶回收试剂盒回收目的片段。
1.3 受精卵的显微注射
回收并纯化注射片段，按常规进行显微注射和受精卵移植[5]。
1.4 转基因鼠的基因型鉴定
1.4.1 鼠尾DNA提取 剪切鼠龄3周的鼠尾3 mm,按［5］制备基因组DNA作为模板。
1.4.2 PCR检测 利用特异性引物扩增,产物长度为573 bp，其引物序列同1.2。PCR反应条件:97 ℃变性7 min,进入循环(94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s)，共30个循环,最后一个循环在72 ℃延伸7 min。10 g/L的琼脂糖40 V电泳。
1.4.3 Southern 杂交检测 取PCR筛选阳性鼠DNA 10 μg， 经37 ℃酶切过夜,阳性对照和阴性对照分别为质粒DNA和正常BALB/C鼠DNA分别经XhoⅠ和HindⅢ酶切后的产物。探针为质粒pTRE-C经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后的片段,长为573 bp。
1.5 RT-PCR检测转基因小鼠体内HCV－C基因的mRNA 表达
利用rtTA工具鼠（本实验室同期制作）来检测转基因阳性的首建鼠中HCV－C蛋白的表达。选用PCR检测和Southern杂交检测均为阳性的HCV-C转基因的首建鼠与rtTA鼠交配产仔。一定月龄的仔鼠经过上述检测，选取两种基因均有表达的双转基因鼠，给服DOX达1个月后，剪取小鼠的各组织(如心,肺,肾,脾,肝等)，提取各组织总RNA，并以其为模板进行RT-PCR扩增，引物序列同1.2，扩增长度为573 bp，β-actin引物序列：正义引物：5′-GATATCGCTGCGCTGGTCGT-3′；反义引物：5′-CGGAACCGCTCGTTGCCAAT-3′，扩增长度为220 bp。取5 ?滋L PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
1.6 HCV-C时空特异性表达的检测
同1.5选取两种基因均有表达的双转基因鼠，给服DOX达1个月后，进行肝组织的免疫化学检测[6]。活体麻醉摘取部分肝叶，将取下的肝叶一部分以10%中性福尔马林固定，石蜡切片。免疫组织化学采用SABC法。抗体使用HCV-C单克隆抗体。将未做HE染色的石蜡切片作常规组织免疫化学处理。
2 结 果
2.1 转基因载体pTRE-HCV-C的构建
根据2b型HCV全长cDNA序列设计上下游引物后，PCR扩增HCV-C基因片段，通过电泳检测后结果表明：扩增得到目的片段HCV-C，大小一致（图1）。质粒pTRE-HCV-C用XhoⅠ和Hind Ⅲ 酶切,其片段长度为1.513 kb，酶切前后电泳结果表明转基因载体pTRE-HCV-C构建成功（图2,3）。
2.2 转基因小鼠的建立
应用PCR进行初步筛选移植受精卵后产生的仔鼠，发现有5只为TRE-HCV-C转基因首建鼠(图4)。Southern Blot分子杂交分析结果表明，5只PCR阳性鼠的基因组DNA均有TRE-C基因片段的整合（图5）。
2.3 HCV-C转基因小鼠的HCV-C mRNA组织特异性表达
RT-PCR结果表明，转基因小鼠的目的基因HCV-C在体内存在有组织表达的特异性（图6）。
2.4 HCV-C转基因小鼠时空特异性表达HCV-C蛋白
免疫组织化学结果表明：喂饲DOX后的转基因小鼠的肝细胞胞质中存在HCV－C蛋白的表达（图7）。
3 讨 论
对于丙型肝炎病毒HCV致病机制的研究是目前的热点之一，而C蛋白是HCV编码的一种重要的结构蛋白，被认为在HCV感染的慢性化过程中以及HCV感染所致肝细胞癌的发生过程中扮演着十分重要的角色[3],蛋白与HBV的X蛋白诸多类似，是抗病毒研究的重要靶位点，有助于探讨HCV的致病机制及其防治。
然而，HCV感染的宿主特异性决定了合适的动物模型的缺乏，严重阻碍了在动物整体水平上对HCV-C致病机制的研究。如果HCV-C小鼠在胚胎期表达，就会对病毒抗原会形成免疫耐受,使得在小鼠体内不一定产生病理改变。那么我们就需要利用一个条件诱导基因表达的系统。四环素调控系统是目前最为广泛使用的条件性的基因调控系统。它具有以下的优点:基础表达水平低和诱导表达水平高;目的基因表达能够人为地控制，调节特异性高,宿主基因不受影响,无相关毒性;在特定时间内调节范围较宽。
与我实验室同期构建的带有四环素调控系统调控元件rtTA的转基因小鼠相呼应，本实验构建了带有四环素调控系统反应元件TRE的HCV转基因小鼠，用显微注射方法将目的基因注入小鼠受精卵,出生动物及其后代经PCR筛选和southern 杂交鉴定,成功地制备了整合有TRE-HCV-C的转基因首见鼠以及它们的子代，且证实了TRE-HCV-C基因可以传代。在这个基础上，我们补充了国际上关于四环素小鼠资源库上的反应部分小鼠类别的一项空白，首次利用四环素反应元件TRE带上疾病相关蛋白HCV-C进行转基因小鼠的制作研究。
理论上，四环素调控系统介导的时空表达HCV-C转基因小鼠在正常情况下应该不能表达HCV－C蛋白，即目的基因处于沉默状态，而与表达ApoE-rtTA基因的四环素调控部分的转基因小鼠交配后获得同时带有两种外源基因的双转基因动物，在食物或饮水中加入DOX，小鼠就能在特定的时间内在肝脏特异性的表达HCV-C，这样就能理想地克服胚胎时期的免疫耐受以及针对肝炎病毒抗原的免疫逃避，使得表达HCV-C的小鼠更为接近病毒感染时的体内状态。而我们的实验也恰恰验证了这一点，实验小鼠仅仅在特定的条件下，特定的组织中才有HCV-C蛋白的表达，成功地为阐明HCV-C蛋白的致病机制及C蛋白与肝细胞癌发生关系提供了较细胞模型更为理想的实验动物体系，同时更为建立四环素调控系统调控下的表达HCV-C的双转基因小鼠的模型奠定了基础。从结果我们分析出，四环素调控系统的研究，在未来的基因治疗有着广阔的应用前景，尤其是对建立一个确切的疾病模型，从而作为研究疾病的机制以及靶向性药物作用的靶位有着不可忽视的作用[7]。至于C蛋白的表达是否会引起HCV感染的慢性化发展过程以及HCV感染所致的肝细胞癌的发生，还需要大量的数据和长期的观察,这与ISHIKAWA T等的看法取得了一致[8]。与此同时，我实验室还构建了携带有tTS的载体rtTA，目前已经发现可以用此载体下调细胞模型上的目的基因的基础表达，动物模型研究正在进行中[9]。
【】
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