未甲基化CpG寡聚脱氧核苷酸对小鼠脾细胞产生免疫球蛋白E的抑制作用
作者：谢海瑞， 沈二霞， 李文益， 吴长有
【摘要】 【目的】 探讨未甲基化CpG的寡聚脱氧核苷酸（CpG ODN）在体外对小鼠脾细胞和纯化B细胞产生免疫球蛋白E (IgE)的作用及其机制。【方法】 在体外，小鼠脾淋巴细胞和纯化B细胞与白细胞介素4（IL-4）+ 抗CD40单克隆抗体（anti-CD40）在CpG ODN存在或不存在的条件下刺激3 d或7 d后，用酶联免疫吸附试验法检测IgE的水平，用流式细胞仪检测CD19阳性B细胞的分裂及活化情况。【结果】 CpG ODN呈剂量及时间依赖性地抑制由IL-4 + anti-CD40诱导的小鼠脾细胞IgE的产生，anti-IFN-γ mAb及anti-IL-12 mAb不能完全拮抗CpG ODN对IgE产生的抑制作用。同样地，CpG ODN抑制小鼠纯化B细胞IgE的产生。进一步分析结果表明，CpG ODN促进B细胞活化及共刺激分子CD80的表达，但抑制B细胞分裂。【结论】 CpG ODN直接作用于B细胞而发挥对IgE的抑制作用，该研究为基础和临床研究提供理论依据。
【关键词】 CpG ODN； IgE； 脾细胞； 纯化B细胞； 小鼠
近来研究发现，未甲基化CpG的寡聚脱氧核苷酸（CpG oligodeoxynucleotide, CpG ODN）变态反应性疾病取得了显著疗效 [1-4]。动物哮喘模型已证实，CpG ODN既可以改善也可以预防变态反应急性发作时所导致的气道高反应性、黏液异常分泌、平滑肌痉挛及气道内嗜酸细胞浸润等症状[1-3]，甚至可以阻止慢性哮喘鼠的气道重塑[4]。最近亦有报道，用豚草-CpG ODN 耦联抗原在豚草生长季节治疗过敏性鼻炎取得了一定的效果[5]。目前，尽管CpG ODN在激活免疫应答方面的作用已经明确，但其作用机理仍不清楚。有研究认为，CpG ODN是通过直接或间接激活多种免疫细胞，诱导产生Th1型细胞因子，如IL-12、IFN-γ和TNF-α等，从而抑制Th2类细胞因子IL-4和IL-5的产生，进一步抑制B细胞产生IgE，抑制嗜酸细胞聚集活化[6,7]。但亦有研究发现，去除IL-12或IFN-γ，CpG ODN仍然可以抑制变态反应的发生[8，9]。为此，我们试图研究CpG ODN在细胞群体水平、单个细胞水平上对B细胞产生IgE的作用。结果表明，CpG ODN可通过细胞因子以外的其他途径来抑制IgE的产生，该结果对CpG ODN的生物学功能有了新的认识，为临床研究提供基础实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
正常雌性6～8周龄BLAB/c小鼠18只，购自中山大学实验动物中心。CpG ODN 1826 (5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′)，由上海生工生物工程公司合成，全链硫代磷酸化修饰，PAGE纯化产品。CFSE购自美国Molecular probes公司。CD19 MicroBeads购自德国 Miltenyi 公司。Anti-CD40、anti-IFN-γ mAb、anti-IL-12 mAb,PE标记的抗CD80单克隆抗体（PE-anti-CD80）及抗CD25单克隆抗体（PE-anti-CD25）、FITC标记的抗CD69单克隆抗体（FITC-anti-CD69）、APC标记的抗CD19单克隆抗体（APC-anti-CD19）以及相匹配的对照抗体、抗小鼠IgE的ELISA检测试剂盒均购自美国BD公司（BD/Pharmingen）。IL-4、RPMI 1640培养液和Hank′s液购自美国GIBCO公司。96或48孔平底培养板及流式细胞仪(Aria)为BD公司产品。ELx 800型酶标仪为美国BIO-TEK公司产品。96孔平底ELISA板为美国Greiner公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞制备 处死小鼠取脾脏，制备单个细胞悬液，以600 × g离心8 min，洗涤细胞2次。加入红细胞裂解液裂解红细胞，用Hank′s液洗涤2次后，将细胞悬浮于RPMI 1640完全培养液(含100 mL/L灭活胎牛血清、50 g/L谷氨酰胺、1 × 105 U/L青霉素及100 mg/L链霉素)中，计数细胞并调整细胞浓度至4 ×106 /L。
1.2.2 细胞纯化 如上制备小鼠脾细胞悬液，按Miltenyi 公司说明书叙述的方法加入抗CD19+ B细胞生物素磁珠，将CD19+ B 细胞从小鼠脾细胞中分离出来，然后将其悬浮于RPMI 1640完全培养液中，并调整细胞浓度至5 ×105 cells/mL。经由FITC-CD19 抗生物素磁珠染色，流式细胞仪分析证明CD19+ B 细胞纯度是91% ~ 95%。
1.2.3 CFSE 标记 将小鼠脾细胞用含0.1% 灭活牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐（PBS）缓冲液洗涤并悬浮，细胞浓度为10 × 106 cells/mL。CFSE按1∶2 000比例加入细胞悬液中，其终浓度为10 μmol/L，于37 ℃环境中培养10 min。接着用RPMI 1640培养液洗涤细胞3次，重悬细胞于RPMI 1640完全培养液并调整脾细胞终浓度为4 × 106 cells/mL。之后，将CFSE标记的脾细胞加入48孔平底培养板中，每孔1 mL，在37 ℃、5％CO2孵箱中培养3 d。
1.2.4 细胞培养 ①将小鼠脾细胞悬液(4 × 106 cells/mL)，纯化B细胞悬液(5 × 105 cells/mL)加入到96孔平底细胞培养板中，每孔200 μL，设3个复孔。分别给予RPMI 1640培养液、IL-4（10 ng/mL）+ anti-CD40（1 μg/mL）和IL-4 + anti-CD40 + 不同浓度CpG ODN，然后将培养板置于37℃、5％CO2孵箱中培养7 d，用ELISA法检测细胞培养上清液中IgE含量。②将小鼠脾细胞与IL-4 + anti-CD40共同培养，并在培养的第0、1、2、3、4、5天，加入CpG ODN (100 nmol/L)，第7 天收集上清液用ELISA法检测IgE含量。③小鼠脾细胞加入IL-4 + anti-CD40 + CpG ODN (100 nmol/L)，或同时分别加入anti-IFN-γ mAb (5 μg/mL) 和anti-IL-12 mAbs (5 μg/mL) 培养，7 d后收集上清液用ELISA法检测IgE含量。④另将小鼠脾细胞悬液（10 × 106 cells/mL)，用CFSE标记或不予标记直接加入到48孔平底细胞培养板中，每孔1 mL，每组设3个复孔，给予RPMI 1640培养液、IL-4（10 ng/mL）+ anti-CD40（1 μg/mL）和IL-4 + anti-CD40 + CpG ODN (100 nmol/L),培养3 d后收集细胞，进行细胞表面染色，利用流式细胞仪分析细胞分裂和活化情况。
1.2.5 ELISA法检测IgE 将分别收集到的不同条件下的细胞培养上清液，按照试剂盒中的说明书进行操作。利用酶标仪进行检测分析。IgE试剂盒检测灵敏度为1.6 ng/mL。
1.2.6 细胞表面染色 收集培养3 d的1 × 106细胞，重悬于100 μL PBS溶液中，加入荧光标记的抗细胞表面特异性抗原的抗体（APC-anti-CD19, PE-anti-CD25, PE-anti-CD80, FITC-anti-CD69），4 ℃避光反应30 min，以含0.05% Tween 20的冰PBS液洗涤2次，用流式细胞仪进行检测。
1.2.7 流式细胞仪分析 应用流式细胞仪（FACS）进行检测。以CD19标记细胞群开窗，Cell quest收集细胞（总数10 000个细胞），并分析流式结果。
1.2.8 统计学分析 本实验利用SAS 8.1软件在机上进行分析。所有计量数据均以ｘ±ｓ表示。各实验均采用对秩进行方差分析，组间差别比较使用Studen-Newman-Keuls法进行。检验水准取α = 0.05。
2 结 果
2.1 CpG ODN对小鼠脾细胞IgE的产生的影响
为了探讨CpG ODN对IgE产生的作用，在IL-4 + anti-CD40刺激小鼠脾细胞的同时加入不同浓度的CpG ODN。结果显示，未经任何刺激的正常小鼠脾细胞不产生IgE，而IL-4 + anti-CD40能诱导细胞产生大量IgE，1 nmol/L组IgE产生的量较IL-4 + anti-CD40组增高，但不具统计学意义（P > 0.05），10 nmol/L CpG ODN组IgE产生的量较IL-4 + anti-CD40组明显减少（P < 0.05），以100 nmol/L CpG ODN组最少（P < 0.05，图 1）。
2.2 不同时间加入CpG ODN对小鼠脾细胞IgE产生的影响
为了观察CpG ODN在免疫应答各个阶段的作用，我们将培养的小鼠脾细胞在IL-4 + anti-CD40刺激后的不同时间加入CpG ODN，用ELISA方法检测IgE产生。结果显示，在刺激后24 h以内，CpG ODN能完全抑制IgE的产生，48 h后再加入CpG ODN，未见有抑制作用 (图2)。
2.3 抗IFN-γ和抗IL-12对CpG ODN抑制小鼠脾细胞IgE产生的影响
小鼠脾细胞经IL-4 + anti-CD40刺激后，在加入CpG ODN同时分别加入抗IFN-γ或抗IL-12单克隆抗体，用ELISA方法检测抗IFN-γ和抗IL-12对CpG ODN抑制小鼠脾细胞IgE产生的影响。结果发现（图 3），抗IFN-γ组和抗IL-12组的IgE水平较CpG ODN组高，差异具统计学意义（P < 0.05）；但与IL-4 + anti-CD40组比较仍明显降低，差异具统计学意义（P < 0.05）。
2.4 CpG ODN均能抑制小鼠脾细胞和纯化B细胞IgE的产生
用IL-4 + anti-CD40 + CpG ODN分别刺激小鼠脾细胞和纯化B细胞，观察CpG ODN对B细胞产生IgE的作用。结果显示（图4A），CpG ODN抑制了小鼠脾细胞IgE的产生，与IL-4 + anti-CD40刺激组比较，差异具统计学意义（P < 0.05），与结果1相一致；在纯化B细胞组（图 4B），两种剂量CpG ODN亦均能抑制由IL-4 + anti-CD40刺激产生的IgE，与IL-4 + anti-CD40刺激组比较，差异具统计学意义（P < 0.05）。
2.5 CpG ODN对B细胞表面活化抗原CD69、CD25及共刺激分子CD80的表达的影响
为了进一步探讨CpG ODN抑制B细胞IgE产生的作用机理，我们检测了B细胞表面CD69、CD25以及共刺激分子CD80的表达。分析结果显示未经任何刺激的小鼠B细胞CD69、CD25和CD80只有极少表达；经IL-4 + anti-CD40刺激后，B细胞表面CD25, CD69, CD80的表达有所增加，而CpG ODN刺激组则显著地促进了CD69、CD25及CD80的表达（图 5）。
2.6 CPG ODN对小鼠B细胞分裂的影响
小鼠脾细胞经CFSE染色后，用IL-4 + anti-CD40 + CpG ODN 培养，观察CpG ODN 对小鼠B细胞分裂的影响。结果显示无刺激剂组(medium组)未见B细胞分裂，在IL-4 + anti-CD40刺激培养条件下，脾细胞分裂3次，而在加CpG ODN组只分裂了1次。这表明CpG ODN抑制了B细胞的分裂，使大部分B细胞只分裂了一次（图6）。
3 讨论
变态反应性疾病正在成为严重危害人类生命健康的一类全球普遍性疾病，因此了解发病机制并制定出有效的方案就显得非常迫切。目前研究证明，Th1与Th2免疫应答平衡失调导致Th2细胞增多和释放Th2类细胞因子是变态反应疾病发生的关键，其特征是生成IgE抗体[10]。
最近研究发现，CpG ODN在动物哮喘模型中可以阻止变态反应症状。实验已证明，CpG ODN可以全身用药[1]，也可以滴鼻[2]或口服[3]，不但可以抑制变态反应的急性发作，而且可以阻止慢性进程[4]。但作用机制并不清楚。变态反应的发生是一个复杂的过程，涉及多种免疫活性细胞和众多细胞因子，而且B细胞活化、增殖、类别转换、直至分化为浆细胞分泌IgE这个过程本身也很复杂。目前研究认为，CpG ODN是通过诱导Th1型免疫应答，抑制Th2型免疫应答来抑制IgE的产生，从而阻止变态反应发生的。大量动物试验[6, 7]也证明CpG ODN促使Th1类细胞因子（如IL-12、IFN-γ等）的分泌，而抑制Th2类细胞因子（如IL-4，5等）及IgE 产生。但亦有研究证明CpG ODN对变态反应的抑制作用不依赖于Th1类的细胞因子[8, 9]。 因此，我们以小鼠脾细胞IgE的产生为指标，从不同角度研究了CpG ODN的抑制作用及其可能的机制。众所周知，IL-4主要由Th2细胞产生，能够促进B细胞分泌IgE，而Zhang等 [11]亦证明，IL-4与anti-CD40联合可有效刺激混合淋巴细胞或纯化B细胞产生IgE。在本研究中，我们用IL-4 + anti-CD40刺激小鼠脾细胞或纯化B细胞，结果表明，IL-4 + anti-CD40亦均能刺激小鼠脾细胞和纯化B细胞产生IgE。当加入CpG ODN后，CpG ODN可以抑制IL-4 + anti-CD40诱导的IgE的产生，而且对免疫反应过程中各个阶段的抑制作用不同。在加入刺激剂24 h内，CpG ODN可显著抑制IgE的产生，而此后抑制作用逐渐减弱，与Peng等[12]在致敏小鼠所获得的研究结果相符合，即CpG ODN可以抑制IgE的产生，但不能下调已产生的IgE。这些结果提示在应用CpG ODN治疗变态反应性疾病时，应早期应用才能发挥作用。
研究证明，TLR 9是CpG ODN激活免疫细胞产生免疫应答所必需的特异性受体[13]，而TLR 9主要存在于B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞等效应细胞上。CpG ODN通过与TLR 9结合而激活B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞，诱导其分泌IL-6，IL-12等细胞因子，而IL-12活化NK细胞和CD4+ T细胞，从而产生IFN-γ和巨噬细胞活化因子等，IFN-γ 促进B细胞分化，产生IgG2a抗体，抑制IgE的产生。为了探讨CpG ODN是否仅通过该途径抑制IgE的产生，我们用anti-IL-12和anti-IFN-γ来阻断他们的生物学活性，结果发现，anti-IL-12 和anti-IFN-γ并不能完全逆转CpG ODN对IgE的抑制作用，因此提示我们CpG ODN有可能还通过其他途径来抑制IgE的产生。Krieg等[14]研究发现，CpG ODN在体内及体外试验中均能直接激活B细胞。为此，我们取纯化的小鼠B细胞与CpG ODN共同培养，ELISA法检测表明，CpG ODN呈剂量依赖式抑制IgE的产生，证明CpG ODN可以直接作用于B细胞抑制IgE的产生。
CD69、CD25分别是在淋巴细胞活化初期和晚期表达的分子，可作为淋巴细胞活化的标志。CD80属共刺激分子，主要表达于B细胞表面，可与T细胞表面的CD28或CD152结合，调节T细胞活化。我们检测的结果表明，CpG ODN可显著刺激小鼠B细胞CD69、CD25及CD80的表达，因此CpG ODN有可能通过该途径间接激活T细胞，诱导Th1型免疫应答，从而抑制IgE的产生。
大量研究证实，B细胞产生免疫球蛋白的种类与B细胞分裂次数有关，IgE的产生需要B细胞分裂的次数要多于其他类别的免疫球蛋白[15]。在本次试验中，IL-4 + anti-CD40促进B细胞分裂，而CpG ODN却抑制由IL-4 + anti-CD40诱导的B细胞的分裂，表明这可能是导致IgE产生减少的机制之一
总之，本研究进一步证明，CpG ODN不但可以通过抑制Th2细胞因子途径而抑制IgE的产生，还可以通过对B细胞的直接作用来抑制IgE产生，为研究CpG ODN的免疫激活机理和临床研究提供了新的思路。
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