地塞米松对急性过敏性哮喘小鼠肺水通道蛋白1的影响
作者：吴葆菁， 李文益， 檀卫平， 麦贤弟， 黄花荣， 李静
【摘要】 【目的】 观察水通道蛋白1(AQP1)在急性过敏性哮喘小鼠肺组织的改变，以及地塞米松对其的影响。【方法】 建立小鼠哮喘模型，并随机分为3组，哮喘模型组、生理盐水对照组和组，治疗组在激发阶段给予地塞米松治疗。检测各组中支气管肺泡灌洗液（BALF）的白细胞总数、分类计数以及IL-5和IFN-γ水平，用RT-PCR、Western blot和免疫组化法检测AQP1mRNA、蛋白质水平和在肺组织的分布，观察肺组织形态学改变。【结果】 (1) 哮喘组BALF中白细胞总数［（52±8）×106/ mL］、嗜酸性粒细胞数［（9.8±1.7）×106/ mL］和IL-5水平［(71±27) pg/mL］均高于对照组(P 均< 0.01)，IFN-γ水平［(294±26) pg/mL］低于对照组(P < 0.05)，治疗后白细胞总数、嗜酸性粒细胞数和IL-5水平均明显下降(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.01)，IFN-γ水平明显上升(P <0.05)；（2）哮喘组AQP1mRNA（1.90±0.29）和蛋白质（1.31±0.10）明显高于对照组(P 均< 0.01)，治疗后表达明显下降(P < 0.01，P < 0.05)； (3)哮喘组肺组织可见较弥漫的炎性改变，黏液分泌增多，血管壁水肿明显，血管周围有大量的炎症细胞渗出物，治疗组形态学改变明显减轻；AQP1在气管黏膜上皮、微血管内皮上皮、支气管周围血管床、炎症细胞呈阳性表达，哮喘组表达呈强阳性，治疗后表达明显减弱。 【结论】 AQP1在急性哮喘小鼠肺组织内过度表达，地塞米松对其有显著的抑制作用，可明显改善小鼠肺部的炎性浸润和肺水渗出的病理生理过程。
【关键词】 过敏性哮喘； 水通道蛋白1； 地塞米松； 白细胞介素5； 干扰素γ
水通道蛋白1(aquaporin-1，AQP1)是20世纪80年代末Agre［1］发现的第一个水通道蛋白。AQP1在人体内分布广泛，存在于不同的组织器官中。AQP1表达和功能异常与某些疾病的分泌增多、水肿及变应反应密切相关［2-4］， 如脑水肿、肾病、变应性鼻炎等。AQP1是肺组织主要的水通道蛋白，是肺组织水转运功能中液体快速转运的通道，对于维持正常肺组织的通气和换气功能起重要用，现已公认水分子运动在哮喘发作时的气道阻塞中起重要的作用。但气道AQPｓ在的哮喘病理生理过程中的作用研究甚少，国内尚未见有关AQPs在哮喘中的作用的研究。本文通过实验观察AQP1在急性过敏性哮喘小鼠肺组织表达的改变，以及地塞米松对其的影响。
１ 材料与方法
1.1 实验动物
雌性C57BL/6小鼠30只，清洁级， 5～6周龄，体质量15～20(18±8) g，由中山大学实验动物中心提供。
1.2 实验材料
鸡卵白蛋白(ovalbumin OVA，Grade V，Sigma，美国)，Trizol（Invitrogen，America），逆转录试剂盒、Taq酶（MBI Fermentas，America），小鼠IL-5、干扰素-γ( IFN-γ)酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、兔抗鼠AQP1多克隆抗体、生物素标记的羊抗兔链霉亲合素生物素酶复合物（武汉博士德工程有限公司），PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组 30只C57BL/6小鼠随机分为3组，分别为OVA致敏/激发组（哮喘组）、生理盐水对照组（对照组）、地塞米松(dexamethasone，DM)治疗组（DM组），每组10只。
1.3.2 急性哮喘动物模型建立 急性哮喘动物模型的建立:方法采用国外［5］的方法加以改进，哮喘组、DM组分别于当天及第14天腹腔注射新鲜配制的1 g/L OVA与100 g/L氢氧化铝混悬溶液0.2 mL(1 g/L OVA 0.1 mL +100 g/L氢氧化铝0.1 mL)致敏，在21、22、23、29和30 d予1 g/L OVA溶液50 μL滴鼻吸入激发哮喘，小鼠出现烦躁不安或安静少动、呼吸加深加快，弓背，前肢缩抬、腹肌痉挛等阳性反应；DM组在2l、22、23、29和30 d滴鼻激发前30 min予地塞米松1.2 mg/kg腹腔注射；对照组同时给予相同体积生理盐水腹腔注射及滴鼻。
1.3.3 标本采集 最后1次滴鼻吸入激发后24～48 h，麻醉小鼠，剪开颈部皮肤，暴露气管、分离气管，经气管缓缓插入套管针，结扎固定，用1 mL注射器吸取0.6 mL磷酸盐平衡溶液（PBS），通过套管将PBS缓慢注入肺内，缓慢回抽，反复3次，收集全部支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar larvage fluid ，BALF）1.0～1.2 mL，回收率>80%。取0.1 mL BALF于血细胞计数板中细胞总数，其余BALF离心(1500 r/min， r=15 cm, 4 ℃，10 min)，上清液保存于-80 ℃冰箱待测细胞因子；沉渣涂片进行细胞分类(计数200个细胞)，计算中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞的百分比，用细胞总数乘以百分比得各类细胞的绝对数。右肺上叶组织放入100 g/L中性福尔马林溶液固定，24 h内完成石蜡包埋；其余肺组织先放入液氮，后置于-70 ℃冰箱保存备用。
1.3.4 BALF细胞因子含量测定 用ELISA法测定BALF上清液中IL-5 和IFN-γ水平。
1.4 RT-PCR检测AQPmRNA的表达
用Trizol法提取肺组织总RNA，取3 μg总RNA进行逆转录，取1 μg cDNA，加入AQPs引物，用Taq酶进行扩增，PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s， 56 ℃（AQP1）、53 ℃（β-actin）退火30 s，72 ℃延伸40 s，72 ℃最后延伸10 min，35个循环。 RT-PCR产物以20 g/L琼脂糖电泳，以β-actin为内参照，采用UVIgelstart图像分析软件测定各条带积分光密度(IOD)值，以AQP/β-actin的IOD比值表示AQPmRNA表达的相对强度。
1.5 Western blot检测AQP1的表达
提取肺组织总蛋白，各组样品分别取总蛋白50 μg，100 g/L SDS-PAGE凝胶电泳，经电转印将蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上。用50 g/L脱脂奶粉封闭。加入稀释度为1 ∶ 400的小鼠AQP1多克隆抗体过夜。辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗(稀释度为1 ∶ 200)，室温孵育1 h，DAB显色。图像分析仪测定各条带的吸光度值作半定量分析。
1.6 肺组织形态和黏液检查
右肺上叶组织切片4 μm厚，行HE及阿新蓝 (AB)染色。
1.7 肺组织免疫组化
组织切片滴加30 g/L H2O2，室温10 min， 30 g/L牛血清白蛋白和50 g/L正常羊血清封闭60 min， PBS冲洗。加入1 ∶ 200兔抗鼠AQP1多克隆抗体，4 ℃过夜、漂洗。滴加生物素标记的二抗链霉亲合素生物素酶复合物，浓度为1 ∶ 500，37 ℃，20 min， PBS洗3次，滴加SABC试剂，20～37 ℃，60 min， PBS洗4次。二氨基联苯胺显色。苏木素复染、脱水、透明、封片。用PBS代替一抗为阴性对照。
1.8 统计学处理
以SP11.0统计软件进行统计分析，数据以ｘ±ｓ表示，各组计量数据凡符合正态分布和方差齐性的数据，采用单因素方差分析（one-way-ANOVA），两两比较采用最小显著差异法（LSD）检验，检验水准α=0.05。
２ 结 果
2.1 肺组织形态和黏液改变
光镜下所见: 哮喘组肺组织可见较弥漫的间质炎性改变，细支气管周围、支气管下黏膜和血管周围有大量的炎症细胞浸润，以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主，上皮细胞部分有脱落，黏液分泌增多，部分可见黏液栓子，血管壁明显水肿，血管周围炎性渗出物明显增多，并可见出血。地塞米松后肺部炎症细胞浸润、黏液分泌、血管壁水肿、血管周围渗出的程度明显轻于哮喘组（图1）。
2.2 BALF中细胞总数及分类计数的变化
哮喘组白细胞总数和嗜酸性粒细胞数均高于正常对照组 (P均 < 0.01)；DM组白细胞总数、嗜酸性粒细胞数和淋巴细胞均低于哮喘组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.01，表2）。
2.3 BALF中IL-5 和IFN-γ水平的比较
哮喘组L-5水平高于正常对照组 (P < 0.01)，IFN-γ水平低于正常对照组 ( P < 0.05)；DM组IL-5水平较哮喘组下降(P < 0.01)，但仍低于正常对照组(P < 0.01)，IFN-γ水平为较哮喘组升高(P < 0.05)，但仍低于正常对照组(P < 0.05，表3）。
2.4 小鼠肺组织AQP1mRNA和AQP1蛋白的表达
哮喘组AQP1mRNA和蛋白含量均显著高于对照组 ( P < 0.01)，DM组AQP1mRNA、蛋白含量均分别为低于哮喘组（P < 0.01，P < 0.05），但高于对照组(P < 0.01，P < 0.05，表4、图2、图3）。
2.5 AQP1在肺组织表达
AQP1在气管黏膜上皮、黏膜固有层的血管内皮细胞、肺泡周围毛细血管内皮细胞、嗜酸性粒细胞数和淋巴细胞呈阳性表达，哮喘组呈强阳性表达，DM组较哮喘组阳性表达减弱，但较对照组强（图4）。
3 讨 论
AQPs是一类存在于细胞膜或细胞内囊泡中的能通透水的蛋白质分子，属古老的跨膜通道蛋白MIP(major intrinsic protein)家族成员，选择性地分布在那些与体液吸收或分泌有关的上皮细胞及可能协同液体跨细胞转运的细胞中，执行着各部位的水分重吸收、液体分泌和细胞内外水平衡功能，对调节水液代谢的生理过程起着关键的作用。已发现乳动物水通道蛋白家族有11个成员(AQP0-AQP10)［6］，现有的报道哺乳动物肺组织AQP有6种［7］，比较明确的有AQP1、AQP3、AQP4和AQP5等4种。AQPs在组织分布上有一显著特点，即在同一细胞定位上，没有两种以上AQPs重迭分布［8］，表明每种AQPs均有特殊的地位和作用，有着各自不同的生理功能。
本实验发现，急性哮喘时细支气管周围、支气管下黏膜和血管周围有弥漫性的炎症细胞浸润，以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主，血管壁明显水肿，黏膜充血、水肿、血管壁的充血，血管周围渗出物增多，杯状细胞增生和（化生）及黏液高分泌，就是说在哮喘急性期气道内的炎症渗出和水分泌与交换明显增多。实验还显示AQP1主要分布在气管黏膜上皮、黏膜固有层的血管内皮细胞、肺泡周围毛细血管内皮细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞上，与文献报道一致［9,10］。哮喘时AQP1表达呈强阳性，AQP1mRNA和蛋白质水平也明显增强，显示在哮喘急性期存在AQP1的过度表达。Verkman等［11］研究发现如小鼠肺毛细血管内皮缺乏AQP1，肺泡毛细血管间水的渗透力可下降90%，证实呼吸道中水通过毛细血管运输主要由AQP1介导。AQP1可以使水快速通过毛细血管内皮细胞进入周围的组织液中，调控细胞间液体量和血管容积的流体静压与胶体膨胀压，对维持气道正常生理功能具有重要作用。King等［12］研究发现在先天缺乏AQP1基因的个体中，用生理盐水静脉灌注后，肺血管壁与正常个体均增厚20%，但是正常个体气道壁增厚44%，而有AQP1基因的个体气道壁没有变化，表明AQP1在肺血管通透性中有重要作用。AQP1的主要作用是清除支气管上皮和血管周围组织的水分，AQP1的过度表达，可使气道内水分明显增多，促进了气道的高反应性，加重了炎症细胞的渗出，增加了气道黏液的分泌。本实验显示哮喘急性期AQP1的过度表达与炎症反应、水分泌与交换增多相一致， AQP1与急性哮喘时炎症浸润、水的异常分泌与交换密切相关，提示AQP1参与了哮喘急性炎症期的发病机制，在哮喘急性期炎症渗出、液体异常流动、水分子阻塞气道的发病机制中起重要的作用。
地塞米松治疗后，气道炎症反应明显减轻，表现为BALF中细胞总数及包括EOS在内的炎症细胞分类计数均下降，气道周围炎症细胞浸润明显减轻，黏液分泌减少，血管壁水肿、血管周围渗出也明显减轻，AQP1在气管黏膜上皮、血管内皮细胞的阳性表达也显著下降， AQP1mRNA及蛋白质水平也明显降低，与姚利等［１3］曾发现糖皮质激素抑制AQP1蛋白的表达的结果一致，提示糖皮质激素可减少气道炎症、减少黏液分泌、减轻黏膜充血、水肿和血管周围渗出，可能与AQP1过度表达受抑制有关。
由于呼吸系统普遍存在着液体的分泌、吸收和转运等复杂的生理和病理过程， AQP1作为肺组织的主要水通道蛋白，对调节肺内水转运起着重要的作用，参与了急性哮喘的病理生理过程，地塞米松可下调哮喘肺组织中AQP1mRNA表达及蛋白质水平，这可能为研究糖皮质激素治疗哮喘的作用机制提供新的方向，也为将来用控制水通道蛋白的液体交换、研制水通道蛋白抑制因子减轻哮喘发作时气道水阻塞提供新的治疗途径。
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