靶向SMPD1基因的RNA干扰对人成纤维细胞凋亡的保护作用
作者：高军， 周灿权 张仁礼， 马芸
【摘要】 【目的】以人包皮成纤维细胞（HFF）为模型，通过系统比较针对不同靶点的小干扰RNA(siRNA)对酸性鞘磷脂酶1 （SMPD1）基因的沉默效果，筛选获得最有效的小干扰RNA序列，同时观察沉默SMPD1对细胞凋亡的保护作用。【方法】设计合成三对靶向SMPD1基因的小干扰RNA作为实验组，同时设立阴性对照组和脂质体组(lipofectamine 2000)，瞬时转染原代培养的HFF细胞，采用荧光定量RT-PCR法及Western blot测定SMPD1表达抑制情况，并用化疗药物丝裂霉素诱导细胞凋亡，MTT法检测siRNA转染对细胞的保护作用。【结果】小干扰RNA1，2，3对SMPD1基因mRNA的抑制效率分别为96.3％，39％，63.2％，以siRNA1最高，最佳浓度为50 nmol/L，最佳作用时间为48 h。SMPD1蛋白在48 h出现沉默效果，96 h开始恢复。50 nmol/L 的siRNA1可以有效抑制化疗药物丝裂霉素引起的细胞凋亡，细胞存活率为73.8％，与对照组存活率65.4％比较差异具有统计学意义。【结论】三对siRNA均具有一定的靶基因沉默效果，其中siRNA1效果最佳，沉默效率达到96.3％；靶向SMPD1基因的siRNA能有效抑制人成纤维细胞的凋亡。
【关键词】 siRNA； SMPD1； 成纤维细胞; 凋亡
1 材料和方法
1.1 细胞培养
选取自身表达SMPD1基因的人包皮成纤维细胞（human foreskin fibroblast，HFF），作为本实验的实验材料。取2005年7月至2006年7月在中山大学附属第一门诊日间手术室进行包皮环切术的6～8岁正常男性儿童切除的包皮组织，进行成纤维细胞的原代培养。在超净台上操作，尽量去除皮下疏松结缔组织，将包皮放入含青霉素（100 U/mL，Sigma）和链霉素（100 ?滋g/mL，Sigma）的PBS液中漂洗两次，加入2.5 g/L胰蛋白酶（Sigma），4 ℃过夜冷消化。次日取出包皮，无菌条件下去除褐色的表皮层，留下白色的真皮层。将组织剪碎移入离心管中，加入1 g/L Ⅳ型胶原酶（Sigma），37 ℃消化1～2 h。用吸管反复吹打使细胞分散，100目细胞筛网过滤后离心，1 000 r/min(r = 15 cm)，5 min。弃上清，加入含100 mL/L胎牛血清、100 U／mL 青霉素和100 ?滋g／mL 链霉素的高糖DMEM培养液（Gibco）重悬细胞，接种至培养瓶中，置体积分数为5%CO2、37 ℃培养箱培养，第3天换液，第5天细胞融合90%，可进行传代。取第3至第9代细胞进行实验。
1.2 siRNA设计合成
根据[3]报道的方法从GENEBANK中检索出人类SMPD1 mRNA全序列（GeneID: 6609），通过同源性比对，找出SMPD1的保守区。利用保守区序列进一步与人类基因组进行比对，找出SMPD1的特异序列，针对这些特异序列设计一系列siRNA的序列，然后通过检证性比对筛选特异性高的siRNA序列进行合成。共合成3对19 bp的siRNA，另设随机序列no target siRNA (NT siRNA)作为阴性对照。SiRNA序列如下：siRNA1正义链5＇-guc uau uca ccg cca uca a-3＇，反义链5＇-cag aua agu ggc ggu agu u-3＇；siRNA2正义链5＇-cua ccu aca ucg gcc uua a-3＇，反义链5＇-gau gga ugu agc cgg aau u-3＇；siRNA3正义链5＇-uua ccg ugu gua cca aau a-3＇，反义链5＇-aau ggc aca cau ggu uua u-3＇。阴性对照正义链5’-uuc ucc gaa cgu guc acg u -3’,反义链5’-acg uga cac guu cgg aga a-3’。由广州锐博生物公司合成。
1.3 优化转染条件
用Invitrogen公司的Block it transfection kit优化转染条件。按照说明书操作，转染前一天细胞消化接种24孔板，用不含抗生素的生长培养基，使转染时细胞30％～50％融合。转染当天更换培养板中的培养基，每孔加400 ?滋L opti-MEM低血清培养基。用50 ?滋LOpti-MED 低血清培养基（不加血清）稀释Block-it Fluorescent oligo，轻柔混合。用50 ?滋L Opti-MED 低血清培养基稀释lipofectamine 2000，轻柔混合，室温下孵育5 min。将稀释后的Block-it Fluorescent oligo和lipofectamine 2000轻柔混合，室温下孵育20 min。将此复合物加到培养板中，前后摇晃板以混合。置体积分数为5％CO2、37 ℃培养箱培养，6 h后换完全培养液，至多24 h用荧光显微镜观察荧光信号强弱。FITC filter（?骔ex = 494 nm, λem = 519 green）检测荧光信号的表达。
1.4 siRNA有效性筛选实验
按照优化的转染条件，转染方法同前，实验组为siRNA1至siRNA3共3组，设立no target siRNA对照，脂质体（Lipofectamine 2000）对照及空白对照。SiRNA浓度为50nmol/L，转染后48 h观察和检测RNA干扰效果。实验重复３次取平均值。筛选出沉默效率最高的一对siRNA进行时间梯度和浓度梯度的转染实验。
1.5 有效siRNA基因沉默的最佳转染浓度和时间的确定
按照优化的转染条件，转染方法同前，选择0.5、5、50、100 nmol/L ４种浓度进行细胞转染，转染24 h收集细胞提取总RNA，进行荧光定量PCR，确定最佳转染浓度。使用最佳浓度转染细胞，分别于转染12、24、48、72 h后收集细胞，同样进行RNA提取，逆转录及定量PCR，确定最佳转染时间。所有实验重复３次取平均值。
1.6 Q-RT-PCR
用Trizol Reagent提取法提取总RNA。Trizol，逆转录试剂盒Super Strip Ⅲ购自Invitrogen公司，无水乙醇，氯仿，异丙醇均为国产分析纯。DEPC为Sigma公司产品。由广州达安基因股份有限公司负责设计合成荧光定量PCR引物及Taqman探针。SMPD1引物序列：正义链5’-TCA CGT GGT CCT GGA CCA T-3’；反义链5’-AGA AGC TGC CAG TGC GGT AT-3’；探针序列5’- CCT ACA TCC TGA ATC TGA CCC AGG CAA A-3’，探针5’端加FAM标记，3’端加TAMRA标记。同时设计出内参照β-actin的引物和探针，在检测SMPD1基因mRNA的同时对每个样品中β-actin的表达进行检测，以校正不同样品之间因RNA总量、质量及逆转录反应效率差异所导致的目的基因的表达差异。β-actin引物序列：正义链5'-GCG CGG CTA CAG CTT CA-3’；反义链5'-TCT CCT TAA TGT CAC GCA CGA T-3’；探针序列5'- CAC CAC GGC CGA GCG GGA- 3’，同样在5’端加FAM标记，3’端加TAMRA标记。按照Trizol说明书进行细胞总RNA提取，用6 ?滋L 1 mL/L DEPC水溶解，取1 ?滋L检测RNA浓度和纯度，5 ?滋L行逆转录，按照Super Strip Ⅲ试剂盒说明进行。取5 ?滋L cDNA行荧光定量PCR，ABI Prism 7700 PCR仪，循环条件：93 ℃预变性3 min，93 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，共进行40个循环。实验结果用目的基因定量值/内参定量值表示，抑制率＝（Lipofectamine 2000定量值-实验组定量值）/ Lipofectamine 2000定量值。
１.7 Western Blot
细胞接种12孔板,密度8×104/mL，每孔1 mL 24 h后转染siRNA，转染后不同时间点（24、48、72、96 h）进行细胞总蛋白提取，BCA法进行蛋白质定量（上海申能博彩）。用蛋白印迹法进行SMPD1蛋白的检测，各组样本各取总蛋白质20 ?滋g上样，经100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶( PAGE)电泳后转PVDF膜。与兔抗人ASM (H-181)多克隆一抗（Santa Cruz 公司）4 ℃孵育过夜。与HRP标记的羊抗兔IgG抗体（武汉博士德）室温孵育1 h后，ECL（Pierce公司）显色，暗室中观察，胶片曝光记录结果。同时用β-actin作为内参确证蛋白上样量一致。1.8 SiRNA转染对细胞凋亡的抑制作用
MTT法检测siRNA对细胞的保护效应。细胞接种96孔板，密度5×104/mL，每孔200 ?滋L，24 h后转染siRNA。转染后48 h加入化疗药物丝裂霉素（日本协和株氏会社），100 ?滋g/mL，干预后24 h加入MTT液，10 ?滋L /孔，37℃孵育4 h，弃原液，加入DMSO 150 ?滋L /孔，振荡10 min，酶标仪测定OD490比值。设立6个平行孔，实验重复三次取平均值。
1.9 统计学处理
用SPSS 11.0统计学软件进行分析，计量资料统计结果以ｘ±ｓ表示，单因素方差分析(One way ANOVA)进行多个样本均数间的显著性检验，两样本比较采用配对资料t检验，检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 细胞形态学观察
成纤维细胞接种后24 h内贴壁，细胞伸展呈梭形或多边形，胞浆丰满，核圆形或椭圆形。细胞密度低时交织成网状，细胞密度高时排列成束状或漩涡状。
2.2 荧光oligo-lipofectamine 2000共转染条件优化实验
设立lipofectamine 0.5、1、1.5 ?滋L, oligo 40、60、80、100 nmol/L.。各组转染效率见表1图1。
2.3 siRNA有效性筛选实验
QRT-PCR结果（图2）表明，各条siRNA对SMPD1基因mRNA表达均有抑制作用，抑制率分别为96.3％，39％，63.2％，其中以siRNA1最明显。各组与NT siRNA比较差异达到统计学意义（P<0.05）。
2.4 有效siRNA基因沉默的最佳转染浓度和时间
2.4.1 有效siRNA浓度梯度检测 因siRNA1抑制效率最佳，选用其进行最佳转染浓度和时间的实验。细胞转染siRNA1，选用 0.5 、5、50、100 nmol/L 4种浓度，设立同样浓度的no target siRNA 及Lipofectamine 2000对照,，转染24 h后收集细胞检测mRNA水平。实验结果（图3）显示各组抑制率分别为64.57％，71.85％，75.11％，39.52％。0.5、5、50、组与NT siRNA比较有统计学差异（P<0.05）。
2.4.2 有效siRNA时间梯度检测 细胞转染siRNA1，浓度50nmol/L，设立同样浓度的no target siRNA 及Lipofectamine 2000对照，分别转染12、24、48、72 h后收集细胞，检测mRNA水平。各组抑制率分别为0，59.68％，77.71％，74.71％（图4）。24h，48h，72h组与NT siRNA比较有统计学差异（P< 0.05）。
2.5 siRNA转染后SMPD1基因蛋白的变化
细胞转染SiRNA1，浓度50nmol/L，设立同样浓度的no target siRNA及Lipofectamine 2000对照,，分别于转染24 h，48 h，72 h，96 h收集细胞，用Western Blot法检测SMPD1蛋白表达。转染后48h SMPD1蛋白表达明显减弱，96 h恢复正常。β-actin 各组无差异（图5）
2.6 siRNA转染后丝裂霉素诱导凋亡检测细胞保护作用
HFF细胞转染各siRNA，浓度50 nmol/L，设立同样浓度的no target siRNA，Lipofectamine，MMC对照及无凋亡空白对照，转染后48 h加入化疗药物丝裂霉素干预，24 h后收集细胞进行MTT实验，检测细胞活力，结果见表2。
3 讨 论
研究表明，导致发育中和抗癌过程中卵泡消失的机制是细胞凋亡[4,5]。启动卵母细胞凋亡的共同信号途径是通过活化鞘磷脂酶，水解鞘磷脂产生神经酰胺，神经酰胺作为第二信使依次启动细胞凋亡下游信号[1]。近几年，一些学者对鞘磷脂酶与卵母细胞凋亡信号之间的关系进行了有益的探索，并进行了鞘磷脂酶（Sphingomyelinase, SMase）基因敲除及神经酰胺拮抗剂S1P促进卵母细胞存活作用的研究[1,6]。这些研究的结果表明，SMase功能的缺如，导致卵母细胞凋亡信号不能启动，使新生小鼠卵巢始基卵泡的贮备量大大增加。体内给予S1P的野生型小鼠卵泡同样可以完全耐受由抗肿瘤治疗引起的凋亡。这些研究给我们这样的提示，鞘磷脂酶基因是调控卵母细胞凋亡的关键基因，如果能够抑制其表达，将对卵母细胞的保护起到重要作用。酸性鞘磷脂酶在一定的外源刺激下能快速活化释放到细胞表面，水解细胞膜上的鞘磷脂导致神经酰胺水平在数秒到数分钟内迅速上升。在细胞凋亡、调节肿瘤细胞生长、参与Fas信号系统的传递等方面发挥着重要作用[7]。本研究选用内源性表达SMPD1的人包皮成纤维细胞，利用siRNA 干扰技术，沉默SMPD1的表达。结果表明siRNA可以有效抑制SMPD1 mRNA及蛋白的表达，抑制率达到96％。丝裂霉素(Mitomycin, MMC)是传统的化疗药物，由轮生链霉菌培养液中提取的有效成分,其分子为C15 H18 N4 O5[8]。其作用机制是抑制细胞有丝分裂及DNA合成。有研究表明丝裂霉素100μg/ml作用24小时是引起细胞凋亡的最佳诱导条件[9]。本实验采用报道的浓度和作用时间，结果表明丝裂霉素组细胞抑制率达到34.6％，在给予siRNA沉默SMPD1后给予化疗药物丝裂霉素，凋亡率为26.2％，细胞存活率显著增高，差异达到显著性水平，说明抑制SMPD1的表达可以抑制鞘磷脂的降解，从而减少神经酰胺的生成，阻断信号传导，抑制细胞凋亡的发生。
基因敲除能取得很好的效果，但在临床应用上是不可行的，其方法太复杂，既使能够实现，SMPD1基因的缺失也会给个体带来很多其它方面的问题，如尼曼匹克症的发生[10]。利用RNA干扰技术沉默特定基因，可实现快速、高效、个体化的基因治疗，且在需要的时候可以解除这种抑制，恢复SMPD1基因的表达，就像使用药物一样，这无疑提供了更为广阔的应用前景。目前siRNA的制备方法主要有化学合成法、DNA质粒载体导入法和病毒载体导入法。后两者都需要整合进宿主的基因组，易导致插入突变，牵涉到生物安全性的问题，为适应将来临床应用的需要，本研究采用化学合成siRNA作为实验材料。化学合成的siRNA还具有转染效率高，对细胞毒性小等优点。我们用化学合成的siRNA转染HFF，转染效率达到80％~90％，SMPD1的表达抑制率很高（96.3％）。siRNA是强大的抑制目标基因表达的工具，在细胞培养中转染siRNA沉默基因表达，只需要浓度为10-50nmol/L的siRNA就足够了。如果siRNA浓度过高，会引起非特异的干扰素反应，使细胞的基因表达普遍受到抑制[11]。本实验观察到，siRNA浓度在0.5~50 nmol/L之间目的基因的抑制率是逐渐上升的，当siRNA浓度达到100 nmol/L时，抑制率下降，而阴性对照no target siRNA的抑制率则上升，说明太高浓度的siRNA会引起“脱靶基因沉默”的不良反应，抑制了目标基因以外的基因表达。哺乳动物细胞中可能缺少产生持续性RNA干扰效应的能力，所以细胞进行2~4次分裂后RNA干扰效应一般会消失[12]。此外siRNA 容易被普遍存在的RNA酶降解，只能维持较短时间的基因沉默作用，在本研究中siRNA转染HFF后，SMPD1基因mRNA水平在48 h达到最大抑制率，蛋白沉默的效应只能维持96 h，其后由于细胞分裂，siRNA降解等原因SMPD1表达恢复到转染前水平。研究表明，通过化学方法修饰功能性siRNA分子的某些基团，能进一步提高沉默效应和稳定性[13]，将更能适应临床应用的需要。
目前国内外尚无有关SMPD1siRNA作用于人包皮成纤维细胞的报道，本研究已经筛选出能有效抑制SMPD1，具有抗凋亡效应的siRNA，为进一步研究将RNA干扰应用于卵母细胞保护、抵抗抗肿瘤治疗过程中化疗药物引起的卵母细胞凋亡、保护女性生殖力打下基础。
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