大鼠实验性牙移动过程牙周组织中Ⅰ型胶原的表达变化
【摘要】 【目的】 研究正畸力作用下大鼠牙周膜中Ⅰ型胶原的表达变化，探讨正畸牙移动过程中牙周组织的改建机理。【方法】 利用SD雄性大鼠建立实验性牙移动模型，采用免疫组织化学染色技术分别观察了大鼠牙周膜中Ⅰ型胶原在机械力刺激下的免疫阳性表达变化及相互关系。【结果】 大鼠牙齿加力后，实验组与对照组牵张区之间的染色统计学上具有显著性差异（P< 0.05），两实验组压缩区与牵张区染色强度差异有统计学意义（P< 0.05），牵张区染色强度明显高于压缩区。牵张区1～3 d开始强表达，一直持续到14 d；压缩区1 d后开始表达减弱，7 d后开始回升。另外发现相当于50～150 g质量的正畸力对大鼠牙周组织无明显破坏。【结论】 机械力作用下，大鼠牙周膜Ⅰ型胶原代谢发生变化:牵张区表达增强，压缩区表达减弱，且与时间密切相关。相当于50～150 g质量的机械力范围是正畸用力的安全范围。
【关键词】 正畸牙移动；Ⅰ型胶原； 免疫组织化学
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立
选取（200±20）g的8周龄健康雄性SD大鼠共56只，随机分为七个时间组，每组8只，根据临床常用的正畸力值将各组进一步分成轻加力（50 g）组、重加力（150 g）组（按同等质量的重力牵引）每小组4只。采用盐酸氯胺酮（4 mL/L）肌注麻醉。将大鼠一侧上颌第一磨牙和前牙间用结扎丝拴正畸用Ni-Ti螺旋弹，测力计测力，建立不同大小正畸力作用下的牙移动模型。对侧未做处理的磨牙作为对照。分别于加力后3、6、12、24 h和3、7、14 d定期处死。
1.2 标本的制备
固定与脱钙：按相应时间段将大鼠肌注麻醉， 40 g/L多聚甲醛左心室灌注处死。解剖上颌骨，保留上颌第一磨牙及周围组织，多聚甲醛溶液固定12 h。19 g/L EDTA（pH 7.4）脱钙液中脱钙30 d。洗净脱钙液，梯度酒精脱水，石蜡包埋。组织切片厚度控制在5 μm，裱于玻片（含20 g/L APES的纯丙酮液处理）上。
1.3 免疫组织化学染色
大鼠的上颌骨冰冻切片，常规LSAB法。主要试剂：第一抗体：兔抗大鼠Ⅰ型胶原多克隆抗体Boster公司（BA0352;正常山羊血清工作液(中山公司SP9001);第二抗体：生物素化羊抗兔IgG (中山公司SP9001);辣根酶标记链霉卵白素工作液(中山公司SP9001);胰蛋白酶（Trypsin）(Difco 88-03-28);DAB显色液(Sigma公司5627)。阴性对照试验：①空白对照,用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)取代一抗;②血清对照,用正常羊血清取代一抗。
1.4 统计学处理
为保证实验结果的可比性，不同组采集的样本均保存至同一时间，由同一实验员在相近时间段和相同条件下进行免疫组化染色。采用Image-Pro Plus图像分析软件对各组牙周膜染色强度进行测量，分析操作由同一实验员在同一时间内采用统一标尺测得，测量次数为3次。在牵张区和压缩区牙周膜根中下1/2区随机选择三个视野，测量其积分光密度值（IOD值），采用SPSS10.0统计软件，将结果进行t检验和双因素方差分析，并采用LSD法进行验后多重比较（Post Hoc Multiple Comparisons）。
2 结 果
在未加力正常对照组，Ⅰ型胶原呈束状排列，整齐一致、无断裂，染色均匀，主要在细胞间质着色（图1Ａ）。实验组压缩区，Ⅰ型胶原纤维排列紊乱，染色不均，3 d后压缩侧可见明显的骨吸收陷窝和多核破骨细胞（图1Ｂ）。实验组牵张区，Ⅰ型胶原束明显增宽，胶原纤维排列整齐（图1Ｃ）。实验组与对照组牵张区之间的染色统计学上具有显著性差异（表1）,但实验组压缩区与对照组压缩区之间，两对照组压缩区与牵张区之间染色强度统计学上无显著性差异。
两实验组压缩区与牵张区染色强度统计学上有显著性差异，牵张区染色强度明显高于压缩区，并与时间有关（表1）：在牵张区实验组加力后3、6 h的Ⅰ型胶原染色强度与对照组比较无明显差异；12 h、1 d开始染色阳性反应信号逐渐增强，第3天达到高峰，第7天、14天的染色阳性信号强度仍高于对照组，但开始逐渐下降。而在压缩区实验组加力第1天的Ⅰ型胶原染色强度开始降低，到第7天，染色强度开始逐渐回升。
3 讨 论
牙移动过程中，牙周膜韧带是最先受力发生改变的组织，牙周膜的动态改建是牙周膜受正畸作用力产生反应的结果，而牙周膜结构的完整性是牙周组织健康的重要保证，是决定正畸效果和稳定性的关键。曾有学者将正畸力作用下牙周膜的生理反应活动看作是伤口愈合过程，因为它同瘢痕修复一样包括细胞外基质结构的再生和重建过程。他们发现高速率的胶原代谢是其显著特征，随刺激时间的延长，胶原的表达呈时间依赖性（time-dependent）变化[5,6]。牙周膜韧带和细胞外基质纤维的主要成分中都包含多种类型的胶原成分[7]，到目前为止，在牙周组织中已发现的胶原成分有Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅻ、ⅩⅣ型胶原。而Ⅰ型胶原作为牙周膜固有纤维的主要成分，对稳定牙－牙槽骨连接，承担咀嚼力起着非常重要的作用[8]。本实验也观察到大鼠牙周膜中深染的Ⅰ型胶原纤维，纤维致密、粗大，分布均匀。因此，Ⅰ型胶原的变化在某种程度上代表了牙周膜对机械力的反应，通过观察其合成与分解可以帮助我们大致认识牙周膜的代谢更新情况。
有研究证明：大鼠牙周膜中的胶原更新速度是其全身组织中最快的，它是牙龈的2倍、皮肤的4倍、骨的6倍，提示高速率的牙周膜更新是正畸牙移动的生物学基础[9]。在机械力刺激下，牙周膜中的一系列信号传导通路被激活，提高了Ⅰ型胶原的合成速度，但同时牙周膜内的溶胶原活性也增加[10]。当胶原的合成速度小于分解速度时，就表现为Ⅰ型胶原含量的减少。本实验证实Ⅰ型胶原的合成与分解确实与外力的存在与否密切相关，且统计结果呈时间依赖性表达。但有关外力大小与Ⅰ型胶原表达量关系的报道还很少见到。在本实验中发现，轻力组（50 g）与重力组（150 g）反应结果无显著性差异，未发现牙周膜纤维断裂、牙槽骨严重吸收破坏、牙根重度吸收等现象，说明50～150 g大小的机械力不会对牙周膜Ⅰ型胶原的代谢产生破坏作用，提示这一机械力大小范围是正畸用力的安全范围。
为了更清楚的研究外力作用下牙周组织所发生的变化，本实验将对照组大鼠磨牙按其生理性移动方向分为牵张区（近中侧）和压缩区（远中侧）分别比较，发现两侧的Ⅰ型胶原表达量无显著性差异，且与各实验组的统计学差异相同，说明正常咬合力状态下，牵张区和压缩区的胶原纤维代谢无明显差别。
外力作用于牙周组织发生一系列生理病理变化，使其从组织学上被划分为牵张区和压缩区。牙槽骨在正畸力作用下发生生物弹性形变和生物塑性形变，激活一系列细胞信号传导途径，细胞生物学活性大大提高，压缩区骨吸收、牵张区新骨沉积，胶原纤维发生改建以形成新的牙－牙槽骨连接。尽管早期研究已发现牵张区和压缩区牙周膜胶原组织的代谢活动均有增加，但同时也观察到其改建过程并非一致。在以大鼠为研究对象的实验中[11-14]，发现其牙齿移动后24～36 h，牵张区成纤维细胞的有丝分裂活动明显增加；Zaki等[1]研究表明牵张区成纤维细胞数目明显增加；有研究发现牵张区Ⅰ型胶原mRNA表达量随受力时间增加，且牵张侧表达量高于压缩区[13]。本试验研究结果显示Ⅰ型胶原在两侧表达强度不一致，牵张区强于压缩区，且与受力时间密切相关，与以上学者的相关研究结果一致。但对于压缩区Ⅰ型胶原的表达还存在很多争议， Sayaka等[12]均在对大鼠磨牙加力研究中发现压缩区Ⅰ型胶原的弱表达；而有学者[3，14]在人牙移动14 d后取其牙周膜细胞进行培养，发现压缩区有很强的Ⅰ型胶原表达信号；本实验研究结果发现压缩区Ⅰ型胶原表达量虽明显低于牵张区，但与正常对照组比较却无显著性差异。考虑这可能与研究对象、方法、材料的不同有关。
【】
ZAKI A E, VANHUYSEN G. Histology of the periodontium following tooth movement[J]. Dent Res, 1963, 42(13): 1373-1379.
NAKAGAWA M, KUKITA T, NAKASIMA A, et al.Expression of the type I collagen gene in rat periodontal ligament during tooth movement as revealed by in situ hybridization[J]. Arch Oral Biol,1994,39(4):289-294.
BUMANN A, CARVALHO R S, SCHWARZER C L, et al. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement[J]. Eur J Orthod, 1997, 19(1):29-37.
FUKUI T, YAMANE A, KOMATSU K, et al. Restoration of mechanical strength and morphological features of the periodontal ligament following orthodontic retention in the rat mandibular first molar[J]. Eur J Orthod, 2003, 25(2):167-174.
STOREY E. The nature of tooth movement[J]. Am J Orthod, 1973 ,63(3):292-314.
TEN CATE A R, DEPORTER D A, FREEMAN E. The role of fibroblasts in the remodeling of periodontal ligament during physiologic tooth movement[J]. Am J Orthod, 1976,69(2):155-168.
BORNSTEIN P, SAGE H. Structurally distinct collagen types [J]. Annu Rev Biochem, 1980, 49(56):957-1003.
MYERS J C, SUN M J, IPPOLITO J A, et al. Human cDNA clones transcribed from an unusually high-molecular-weight RNA encode a new collagen chain[J].Gene, 1993, 123(2):211-217.
RYAN M E, GOLUB L M. Modulation of matrix metalloproteinase activities in periodontitis as a treatment strategy[J]. Periodontology, 2000,24:226-238.
OZAKI T, MIURA F, SHIMIZU M. Collagenolytic activity during tooth movement in the rabbit[J]. Arch Oral Biol, 1971, 16(9):1123-1126.
JOHNSON R B. Synthesis of alveolar bone Sharpey′s fibers during experimental tooth movement in the rat[J]. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol, 2005,284(1):485-490.
DOMON S, SHIMOKAWA H, YAMAGUCHI S. Temporal and spatial mRNA expression of bone sialoprotein and type I collagen during rodent tooth movement [J]. Eur J Orthod, 2001,23(4):339-348.
VON BOHL M, MALTHA J, VON DEN HOFF H, et al. Changes in the periodontal ligament after experimental tooth movement using high and low continuous forces in beagle dogs[J]. Angle Orthod, 2004, 74(1):16-25.
MUSSIG E, TOMAKIDI P, STEINBERG T. Molecules contributing to the maintenance of periodontal tissues their possible association with orthodontic tooth movement [J]. J Orofac Orthop, 2005 ,66(6):422-433.
