可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的原核表达、鉴定与纯化及其对皮质神经元的跨膜转导
作者：周国钰， 胡学强， 胡 骏， 陆正齐， 楼之茵， 朱灿胜， 熊洁萍
【摘要】 【目的】 构建含蛋白转导域(protein transduction domain, PTD)与脑红蛋白(neuroglobin, Ngb)融合基因的表达质粒，原核表达可溶性TAT PTD-Ngb，并鉴定、纯化，检测TAT PTD-Ngb对皮质神经元的跨膜转导功能。【方法】 提取SD大鼠脑组织总RNA，通过RT-PCR法构建编码TAT PTD-Ngb的融合基因，克隆入pET28b原核表达载体，转化入大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析及可溶性鉴定，利用所表达的目的蛋白上的6个组蛋白用Ni-NTA琼脂进行亲和层析纯化，将不同浓度纯化的融合蛋白与原代培养皮质神经元共孵育2 h，用Western-blot分析融合蛋白的跨膜转导。【结果】 成功构建了含有TAT PTD-Ngb的原核表达载体，插入片段500 bp，成功表达并纯化了可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白，相对分子质量约为20 k，Western blot鉴定显示表达蛋白具有抗原性，并具有转导入原代培养皮质神经元的功能，随给予蛋白浓度的增高进入神经元内的融合蛋白量增高。【结论】 可溶性融合蛋白TAT PTD-Ngb可转导入皮质神经元，对进一步研究Ngb的功能及蛋白转导技术的应用奠定了基础。
【关键词】 蛋白转导域； 脑红蛋白； 可溶性原核表达
合入扩增的Ngb 5′端，构建含有TAT PTD-Ngb融合基因的原核表达质粒，诱导表达、鉴定及纯化，用原代培养的原代皮质神经元对其跨膜转导功能进行检测，为下一步利用蛋白转导技术研究Ngb在神经系统内的功能奠定基础，提供新的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒和菌株 T7 RNA聚合酶调控的表达质粒pET28b及表达T7 RNA聚合酶的大肠杆菌BL21（DE3）plysS购自Novagen公司；pMD19-T simple载体购自大连宝生物工程公司；大肠杆菌DH5α由本校药教研室胡骏博士赠送。
1.1.2 试剂 Trizol试剂购自Invitrogen公司；合成cDNA第一链的逆转录试剂盒购自Fermentas公司；Taq DNA聚合、T4 DNA连接酶和各种限制性内切酶购于大连宝生物工程公司；X-gal、IPTG购于AMRESCO公司；质粒抽提试剂盒、胶回收纯化试剂及Ni-NTA蛋白亲和纯化琼脂购于QIAGEN公司；抗His-Tag小鼠单克隆抗体购于TIAGEN公司，羊抗小鼠二抗购于武汉博士德生物技术有限公司；氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素均为SIGMA分装；ECL试剂购自PIERCE公司；Neurobasal培养基及B27购自Gibco公司。其余常规试剂均为进口或国产分析纯。
1.1.3 PCR引物 根据Genbank中大鼠Ngb和TAT-PTD基因序列设计了两条引物，即在Ngb成熟肽基因序列的5′端融合了含有PTD基因序列，由上海生工生物技术有限公司合成。上游引物：5′CATATGAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA GCTAGCATGGAGCGCCTAGAGTCAGAGCT 3′（含NdeⅠ、NheⅠ酶切位点）；下游引物：5′ GAGCTCTA CTCCCCGTCCCAGCCTCG 3′（含SacⅠ酶切位点）。扩增产物片段500 bp。
1.1.4 实验动物 SD乳鼠由中山大学实验动物中心提供。
１.2 TAT PTD-Ngb基因的克隆
1.2.1 RT-PCR扩增TATPTD-Ngb基因 取SD乳鼠脑组织用Trizol试剂提取脑组织总RNA，按逆转录试剂盒说明合成cDNA第一条链，取2 μＬ逆转录产物进行PCR，反应条件如下：94 ℃预变性5 min ，94 ℃ 30 s、68 ℃40 s、72 ℃ 1 min ，循环30次，72 ℃延伸10 min。PCR 产物进行0.15 g/L琼脂糖电泳分析，并对目标条带切胶回收。
1.2.2 PCR产物的克隆与测序 PCR 产物经胶回收纯化后与pMD19-T simple载体用T4 DNA连接酶16 ℃连接2 h，转化DH5α感受态，涂布于含氨苄青霉素的LB 平板上，菌落经蓝白班筛选，抽提质粒经NdeⅠ / NheⅠ限制性内切酶双酶切鉴定，选取含目标片段的单克隆菌落并送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.2.3 TAT PTD-Ngb表达质粒的构建 用NdeⅠ / NheⅠ限制性内切酶从阳性TA克隆载体上切下TAT PTD-Ngb基因序列并胶回收，与同样酶切的含His-tag的pET28b表达载体16 ℃连接反应2 h，构建表达质粒pET-TAT PTD-Ngb，简称pETPN，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布于含50 μg/ mL卡那霉素的LB平板上，挑选菌落、质粒抽提并经酶切鉴定筛选阳性单克隆，送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.3 TAT PTD-Ngb融合蛋白的表达、纯化与鉴定
1.3.1 TAT PTD-Ngb融合蛋白的表达及可溶性分析 经酶切鉴定的pETPN质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）plysS感受态，形成稳定的高表达细菌株，在含50 μg/ ml卡那霉素的LB平板上划单菌落，挑取单菌落接种于5 ml LB培养液中(含卡那霉素50 μg/ mL，氯霉素37 μg/mL)，37 ℃ 200 r/ min 振摇过夜；次日按1 ∶ 100的比例接种至10 mL上述 LB培养液中，37 ℃ 200 r/min振摇，培养约2～3 h，A值至0.6左右，加入终浓度为0.4 mmol/L 的IPTG，37 ℃ 200 r/min诱导表达0，1，2，4，6，8 h，离心收集细菌沉淀，按10 ∶ 1的比例的加入20 mmol/L Tris·Cl溶液，超声破碎细菌，SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。取诱导表达8 h的细菌沉淀超声破碎产物4 ℃下15 000× g 离心30 min，分别收集上清和沉淀，加入SDS-PAGE电泳上样缓冲液，检测上清和沉淀中TAT PTD-Ngb融合蛋白的表达。
1.3.2 TAT PTD-Ngb融合蛋白的Wester blot分析 取诱导表达8 h上清经SDS-PAGE 电泳，电泳完毕把蛋白转印硝酸纤维膜上，0.5 g/L脱脂奶粉封闭2 h，抗融合蛋白6×His-tag单克隆抗体4 ℃过夜孵育， HRP标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL试剂曝光显影定影分析。
1.3.3 可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的纯化、脱盐与储存 收集诱导表达8 h的细菌沉淀，用含10 mmol/L咪唑的溶解缓冲液重悬菌体，超声破碎后离心收集上清，然后加入Ni-NTA树脂，之后分别用含20 mmol/L，250 mmol/L咪唑的缓冲液纯化表达的TAT PTD-Ngb融合蛋白。纯化蛋白经PD-10脱盐柱进行脱盐，溶于含100 mL/L甘油的Neurobasal培养基中，-80 ℃保存备用。
1.4 TAT PTD-Ngb对皮质神经元的跨膜转导
1.4.1 原代皮质神经元的培养 取出生24 h以内的SD乳鼠，无菌条件下分离皮质，经浓度为2.5 mg/L胰酶消化（37 ℃,15 min）分散后，加入52 mg/mL胰酶抑制剂终止消化，细胞沉淀用含CaP2+、MgP2+的解剖液洗涤后离心去上清，加入含2 mL/L B27的Neurobasal培养基内，以0.5×106/mL的密度种植在用多聚赖氨酸包被好的培养皿中35 mm培养皿（2 mL/皿）中，置于含体积分数5%CO2、37 ℃的培养箱中培养，每3-4 d半量换液1次。神经元培养至第7天用于实验。
1.4.2 TAT PTD介导的Ngb蛋白的跨膜转导及其检测 培养的神经元用Neurobasal培养基全量换液，培养基内加入不同终浓度TAT PTD-Ngb蛋白（0，0.1，0.5，1.0，2.0 μmmol/L）37 ℃培养箱内孵育2 h，吸去培养基，PBS洗涤，收集、裂解细胞，细胞裂解液进行Western-blotting分析，用抗融合蛋白上的6×His-tag单克隆抗体检测进入细胞内的融合蛋白，并以纯化的TAT PTD-Ngb融合蛋白做为阳性对照。
2 结 果
2.1 TAT PTD-Ngb融合基因的RT-PCR扩增
从SD大鼠脑组织中提取脑组织总RNA，逆转录后PCR 扩增，15 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，得到与预期大小一致的DNA 片段（500 bp），经TA克隆并测序完全正确（图1）。
2.2 重组pETPN质粒的酶切鉴定
重组pETPN质粒经NdeⅠ / NheⅠ双酶切后电泳，显示切出与目的基因大小一致的DNA片段（图2）。插入片段经测序证明插入位置正确，无突变，表明克隆载体含有TAT PTD-Ngb基因序列,测序结果见图3。
2.3 TAT PTD-Ngb融合蛋白的原核表达
与对照菌相比，pETPN BL21(DE3)plysS重组菌IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳分析有目标分子量新的的蛋白产生，表观分子量20 ku左右，随诱导时间延长目的蛋白表达量增高（图4a，箭头所示为目的蛋白条带），可溶性分析显示，上清中有目的蛋白，蛋白为可溶性（图4b）。
2.4 TAT PTD-Ngb融合蛋白Western blot鉴定
为进一步对融合蛋白进行验证，将细菌诱导表达前与诱导表达8 h的产物上清用抗融合蛋白的6×His-tag单克隆抗体进行Western-blotting分析，结果显示融合蛋白在 约20 ku显示单一条带，与预计的目的蛋白分子量相符（图5），表明表达的目的蛋白具有抗原活性，而含pET28b质粒的对照菌在诱导表达前与诱导表达8 h均无此条带。
2.5 可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的纯化
取诱导表达8 h含大量TAT PTD-Ngb融合蛋白的表达产物，利用TAT PTD-Ngb融合蛋白上的6×His标签，用Ni-NTA进行亲和纯化，纯化产物分析结果见图6。凝胶经灰度扫描分析显示，纯度在95%以上。
2.6 TAT PTD介导的Ngb对原代培养皮质神经原的跨膜转导
将TAT PTD-Ngb融合蛋白分别以不同终浓度加入原代培养皮质神经元培养基内，孵育2 h后，提取细胞内蛋白，以抗6×His-tag单克隆抗体检测细胞内融合蛋白含量，结果显示，细胞内检测到TAT PTD-Ngb融合蛋白，与对照的融合蛋白条带相同，并且随着给予融合蛋白浓度的增高，检测到细胞内融合蛋白量增高（图7）。
３ 讨 论
本实验以pET28b为载体，成功构建了融合蛋白TAT PTD-Ngb的原核表达质粒，诱导其表达，并利用pET28b上的6×His-tag纯化出高纯度的可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白。纯化后的蛋白经Western-blot检测，与特异性抗体具有良好的特异性反应及抗原活性。我们将一定浓度的经纯化的TAT PTD-Ngb融合蛋白与原代培养的皮质神经元共同孵育后，Western-blot分析可检测到细胞内存在融合蛋白，且融合蛋白的含量随加入培养基内融合蛋白终浓度的增高而升高。这表明通过 TAT PTD的介导，Ngb可穿过细胞膜进入细胞内，TAT PTD-Ngb融合蛋白具有跨膜转导活性，进入量具有蛋白浓度依赖性。
脑红蛋白(neuroglobin，Ngb)是Burmester[4]等于2000年首次报道的在一种人和小鼠的脑内存在的，在神经系统中大量特异性表达的携氧球蛋白，Ngb在对氧大量需求的神经系统中广泛表达。大量研究显示，缺氧能够诱导Ngb表达，与其他的携氧球蛋白相似，Ngb能够可逆性地与氧结合，并与氧有极高的亲和力，在急性缺血缺氧的情况下可迅速地释氧，从而提高神经细胞的存活率和功能的发挥，降低其表达则会增加组织和细胞的缺氧损伤程度[5]。研究推测，Ngb可能作为一个神经保护因子而起作用，可作为内源神经保护因子成为缺血缺氧性脑损伤的研究目标。但是目前仍不明确Ngb在生理及病理状态下的神经保护机制。因此，Ngb能否以及如何用于脑血管疾病十分值得探讨。
研究证明，HIV-1 TAT-PTD具有独特的跨膜运转方式，可以引导多种多肽和蛋白质进入目标细胞，转导速度快、效率高，而且它所引导的蛋白质可以具有很大的分子量，能将相对分子质量超过1 000 k的蛋白质转运到大部分哺乳动物细胞内，而且大的粒子转运入细胞不影响细胞活力和蛋白活性与功能[6]。重要的是，TAT PTD介导的蛋白质甚至可以直接通过血脑屏障直接进入脑组织和神经元，因此该技术将对于治疗神经系统疾病有重要意义，已有学者将如BCL-XL、GDNF、FNK、XIAP等具有脑保护作用的因子利用PTD的转导功能将其引入脑缺血模型，取得了良好的保护效果[7-10] ，并且与将蛋白引入细胞的传统方法如蛋白微注射、穿孔蛋白及脂质体法等相比，TAT PTD 介导的蛋白转导有着显著的优越性。蛋白转导不依赖于受体和转运蛋白，也不需要能量，具有浓度和时间依赖性，这一过程可能和蛋白转导域中存在碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)有关，这些带有强正电荷的氨基酸, 通过直接与带负电荷的细胞膜脂类相互作用而介导穿膜过程[11]，最近的研究认为细胞膜脂质筏介导的巨胞饮参与了蛋白转导机制 [12]。目前的研究发现，TAT序列中具有转导作用的最小序列是富含碱性氨基酸，具有较多正电荷的多肽片段：从49至57这9个氨基酸残基RKKRRQRRR，它与以前许多研究者曾经使用的11个氨基酸的序列PTD序列具有相似的蛋白转导效率[11]，我们的研究中，TAT PTD即采用了这一最小的9个氨基酸序列，进一步减小了蛋白转导域对其所引导蛋白的影响及HIV TAT-PTD可能具有的目前尚不清楚的副作用。
本实验可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的表达、纯化及其跨膜转导入皮质神经元，为进一步应用蛋白转导技术进行Ngb的神经保护机制研究奠定了基础，为Ngb应用于脑血管疾病及其他神经系统疾病创造了可能，为蛋白转导技术作为一种新颖的分子治疗措施应用于临床提供了依据。
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