用液相芯片技术定量测定人血清CEA、AFP和HBsAg
作者：陈玮， 李明， 吴英松， 李妙艳， 何蕴韶
【摘要】 【目的】 采用液相芯片技术同时定量测定人血清中癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）和乙肝表面抗原（HBsAg），并对该方法进行评价。【方法】 制备抗体交联微球及生物素标记抗体，用双抗体夹心法对临床血清标本进行测定。【结果】 同时检测CEA、AFP和HBsAg时的线性范围分别为0.032～200 ng/mL、0.022～55 U/mL、0.26～1 000 ng/mL，最低检测限分别为8.90 pg/mL、0.013 U/mL、0.24 ng/mL，批内变异系数（CV）< 9%，批间CV < 14%。检测CEA、AFP、HBsAg的灵敏度分别为96.4％、95.8％、92％，特异度分别为95.6％、94.2％、100％，准确度分别为96％、95％、96％。其检测结果与化学发光免疫分析法（CLIA）或时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）之间呈显著的等级相关关系。该方法仅需1 ?滋L标本，3 h即可完成检测。【结论】 液相芯片技术具有可联合检测多项指标、高通量、线性范围广、灵敏度高、重复性好、节省样品和时间等优点，具有临床应用潜力。
【关键词】 液相芯片； 微球悬浮阵列技术； Luminex； 肿瘤标志物； 乙型肝炎表面抗原
Abstract: 【Objective】 To simultaneously quantify carcinoembryonic antigen (CEA), alpha fetoprotein (AFP), and hepatitis B surface antigen (HBsAg) in human serum using multiplexed Luminex assay and evaluate the assay performance. 【Methods】 Biotinylated detection antibodies and microspheres coupled with capture antibodies were prepared. A sandwich immunoassay was established to measure the three analytes in serum samples. 【Results】 Linear ranges were 0.032～200 ng/mL, 0.022～55 U/mL, 0.26～1 000 ng/mL, and detection limits were 8.90 pg/mL, 0.013 U/mL, 0.24 ng/mL for CEA, AFP, and HBsAg, respectively. The intra-and inter-assay coefficients of variation were less than 9% and 14% respectively. For CEA, AFP, and HBsAg, sensitivity were 96.4%, 95.8% and 92%, specificity were 95.6%, 94.2% and 100%, and accuracy were 96%, 95% and 96%, respectively. Significant Spearman rank correlations were found between the results obtained by Luminex assay and by chemiluminescence immunoassay (CLIA) or time-resolved fluorescence immunoassay (TRFIA). Only 1 microliter of serum and 3 hours were needed for Luminex assay. 【Conclusion】 With the advantages of unique capability of multiplexing and high-throughput, good reproducibility, increased detection range and sensitivity, Luminex assay would have a great potential in clinical application.
Key words: liqui chip; suspension bead array; Luminex; tumor markers; hepatitis B surface antigen
[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(1): 105-109；114] 肿瘤标志物对于肿瘤普查、诊断、分期、疗效监测及预后判断等具有重要价值，临床上常联合检测多种标志物以提高肿瘤诊断的阳性率和特异性，但目前常用的检测手段如放射免疫测定、酶联免疫测定、化学发光法等仅能单独检测。液相芯片是一种新型生物芯片技术平台，它在不同荧光编码的微球上进行抗原-抗体及核酸杂交反应，通过两束激光分别检测微球编码和荧光信号以达到定性和定量分析目的。除了具有快速、灵敏、灵活、高通量等显著特点外，液相芯片最大优势在于可同时对同一样本中多达100种不同目的分子进行分析[1]。本研究应用液相芯片技术利用双抗体夹心免疫分析原理同时检测了人血清中的癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）和乙肝表面抗原（HBsAg），评价了该方法的线性范围、最低检测限、精密度、灵敏度、特异度、准确度等指标，并对检测结果与化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）和时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）进行了相关性分析。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
单克隆抗体购自芬兰Medix公司和美国Fitzgerald公司，癌胚抗原（CEA）和甲胎蛋白（AFP）抗原购自美国Biodesign公司，重组乙肝表面抗原（HBsAg）购自上海精睿生物科技有限公司。羧基化微球购自美国Luminex公司。牛血清白蛋白（BSA）购自美国Fitzgerald公司。2-吗啉乙磺酸(MES)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）和生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯购自美国Sigma-Aldrich公司。碳二亚胺（EDC）购自美国Pierce公司。藻红蛋白标记的链霉亲和素（SA-PE）购自美国Molecular Probes公司。带滤膜离心管、MultiScreen MABVN 1.2 ?滋m滤板和真空抽滤装置购自美国Millipore公司。Bio-Plex检测系统购自美国Bio-Rad公司。100份正常血清标本（健康体检者）、100份CEA/AFP阴性和阳性血清标本（采用Bayer全自动化学发光免疫分析仪检测CEA和AFP）和100份HBsAg阴性和阳性血清标本（采用Roche电化学发光免疫分析法检测）来自解放军301、南方医院和广州军区总医院。HBsAg时间分辨荧光免疫分析试剂盒由广州达瑞抗体工程有限公司提供。
1.2 微球的交联[2]
取100 ?滋L羧基化微球，用去离子水、活化缓冲液（0.1 mol/L NaH2PO4，pH 6.2）各洗1次，重悬于80 ?滋L活化缓冲液。先后加入10 ?滋L新鲜配制的Sulfo-NHS溶液（50 mg/mL）、10 ?滋L EDC溶液（50 mg/mL），混匀，室温避光振摇20 min。然后11 340 ×g离心4 min，沉淀用150 ?滋L交联缓冲液（0.05 mol/L MES，pH 5.0）洗2次，重悬于100 ?滋L交联缓冲液。加入7 ?滋g包被抗体，并用交联缓冲液补足体积至500 ?滋L，室温避光温和振荡2 h。离心微球，沉淀加入250 ?滋L封闭/贮存液（1 mg/mL BSA，体积分数0.02%吐温20，0.01 mol/L叠氮钠，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4）室温振摇30 min，封闭/贮存液洗2次并最后用300 ?滋L重悬微球，4 ℃避光保存。
1.3 抗体的生物素标记
将0.5 mg检测抗体加入带滤膜离心管中，4 300 ×g离心5 min，再用0.05 mol/L NaHCO3（pH 8.8）反复洗5次并调整质量浓度至2 mg/mL。加入10 ?滋L生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯（10 mg/mL），混匀，室温静置60 min。反应结束后，于PBS中透析24 h，分装抗体，4 ℃保存。
1.4 标准品的制备
用标准品稀释液（15 mg/mL BSA，体积分数0.01%吐温20，0.01 mol/L叠氮钠，0.01 mol/L PBS，pH 7.4）配制同时含有3种抗原的不同质量浓度（溶液标度）的标准品。
1.5 交叉反应的检测
已交联CEA、AFP、HBsAg包被抗体的微球分别单独与1种抗原及1种生物素标记抗体孵育后，检测荧光值。
1.6 操作方法
用分析缓冲液（10 mg/mL BSA，0.01 mol/L叠氮钠，0.01 mol/L PBS，pH 7.4）配制稀释微球混合物，使不同编码的微球均为80个/?滋L。滤板上各孔加入100 ?滋L分析缓冲液预湿，真空抽滤去除液体，各孔分别加入25 ?滋L标准品、血清标本（预先用分析缓冲液25倍稀释）或者分析缓冲液，最后每孔加入25 ?滋L稀释微球混合物，室温避光振荡孵育60 min。真空抽滤去除孔内液体，每孔用100 ?滋L洗涤液（体积分数0.05%吐温20，0.01 mol/L PBS，pH 7.4）洗3次，随后每孔加入25 ?滋L生物素标记抗体，室温避光振荡孵育60 min。同前抽滤并洗涤3次后，每孔加入25 ?滋L SA-PE，室温避光振荡孵育30 min。再次抽滤并洗涤3次后，每孔加入125 ?滋L洗涤液重悬微球，并在Bio-Plex检测系统上读取各孔荧光值。
1.7 评价指标
1.7.1 线性范围 将CEA、AFP和HBsAg 3种标准品混合并稀释成不同质量浓度（溶液标度）进行测定，做出各自的标准曲线。
1.7.2 最低检测限 测定20个空白孔的荧光值，其平均值（ｘ）及标准差（s）。以 ｘ＋2s再减去本底值代入CEA、AFP、HBsAg的标准曲线方程中，所得值即为最低检测限。
1.7.3 精密度 选取CEA、AFP、HBsAg水平均高于正常值的3个血清标本进行测定。考察批内精密度时，3个血清各设8个复孔；考察批间精密度时，3个血清各测3次，每次各设8个复孔，计算CEA、AFP、HBsAg质量浓度（溶液标度）的平均值、标准差及CV值。
1.7.4 正常值范围 检测100份健康体检者血清标本，用SPSS 13.0软件统计CEA、AFP、HBsAg水平的分布情况，以百分位数法得出正常参考值范围。
1.7.5 与CLIA和TRFIA的比较 用液相芯片法测定100份CEA/AFP临床血清标本和100份HBsAg临床血清标本，统计各项指标的阳性和阴性血清数，液相芯片法的检测灵敏度、特异度和准确度。用HBsAg时间分辨荧光免疫分析试剂盒测定上述100份HBsAg临床血清标本。
1.8 统计学处理
使用SPSS 13.0 for Windows软件进行统计学处理。对两个样本率的比较采用四格表卡方检验；对液相芯片法与CLIA或TRFIA的检测结果采用Spearman等级相关分析。检验水准，?琢=0.05。
2 结 果
2.1 交叉反应
CEA、AFP、HBsAg的3对抗体与无关抗原或抗体反应时荧光值低，而与相应抗原或抗体反应时特异信号高（表1），说明抗体特异性好，无明显交叉反应。
2.2 线性范围
同时检测CEA、AFP、HBsAg时，CEA标准曲线的线性范围为0.032～200 ng/mL，AFP为0.022～55 U/mL，HBsAg为0.26～1 000 ng/mL，分别达到3.8、3.4、3.6个对数值（图1）。
2.3 最低检测限
计算得出CEA、AFP、HBsAg的最低检测限分别为8.90 pg/mL、0.013 U/mL、0.24 ng/mL。
2.4 精密度
CEA、AFP、HBsAg的批内CV为4.8%～8.9%，批间CV为5.8%～13.8%（表2、3），说明具有较好的重复性。
2.5 正常参考值范围
用液相芯片法检测100份健康体检者血清标本，CEA最低值为0 ng/mL，最高值为6.80 ng/mL，平均值为1.85 ng/mL，标准差为2.98 ng/mL，99.1%的样本CEA水平在6.7 ng/mL以下，因此该方法检测血清CEA的正常参考值范围为0～6.7 ng/mL；检测AFP的最低值为0.13 U/mL，最高值为15 U/mL，平均值为2.62 U/mL，标准差为2.30 U/mL，99.1%的样本AFP水平在10 U/mL以下，因此检测血清AFP的正常参考值范围为0～10 U/mL；检测HBsAg时所有标本均为0 ng/mL，因此检测血清HBsAg的正常参考值为0 ng/mL。
2.6 与其它方法的比较
以Bayer化学发光免疫分析法或Roche电化学发光免疫分析法（electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA）作为参照标准，液相芯片法检测临床阳性和阴性血清标本的灵敏度、特异度和准确度（表4～6）。
由于Roche电化学发光法检测HBsAg仅能定性，因此又使用了HBsAg时间分辨荧光免疫分析试剂盒对这100份HBsAg临床血清标本进行定量测定。然后对两种不同方法所得测值之间的关系采用Spearman等级相关分析，得出液相芯片法与CLIA测定CEA的相关系数rs=0.967，P < 0.01；与CLIA测定AFP的相关系数rs为0.943，P < 0.01；与TRFIA测定HBsAg的相关系数rs=0.926，P <0.01，表明液相芯片法与CLIA或TRFIA的血清测值之间存在显著的等级相关关系。比较液相芯片法与CLIA/TRFIA（表7），可见液相芯片法在精密度方面与CLIA/TRFIA相当，但检测范围更宽，而且标本用量远远少于后者。
3 讨 论
液相芯片是一种非常灵活的多功能技术平台，可进行蛋白、核酸等生物大分子检测及酶学分析、受体和配体识别分析等研究，被喻为后基因组时代的芯片技术。其基础是1997年由美国Luminex公司开发出来的xMAP（flexible multi-analyte profiling）技术。它主要通过可偶联探针的荧光编码微球与两束激光检测实现对被测物的定性和定量分析，一个反应孔内可以完成100种不同的生物学反应[3,4]。液相芯片的独特设计使它拥有常规检测方法难以媲美的优点：通量大，可对多种目的分子同时分析，大大提高工作效率；液相环境更有利于保持生物大分子的天然构象，也更有利于反应进行；灵敏度、准确性高，重复性、灵活性好；只需要微量的样品即可进行检测[5,6]。以检测细胞因子为例，ELISA的检测范围仅1～2个数量级，而液相芯片法最高检测浓度为16 000～32 000 pg/mL，达到3～4个数量级，灵敏度也远胜于ELISA，为2～4 pg/mL，而且两种方法的检测结果相关性好，因此液相芯片法将来极有可能成为ELISA的替代方法[7,8]。目前国外将液相芯片技术用于基础研究和临床检测日益增多，包括检测细胞因子、过敏原、自身抗体、激素、SNP以及感染性疾病诊断、HLA分型、基因表达分析等[9-12]，国内报道尚不多见。
CEA、AFP是临床常用的肿瘤标志物， HBsAg阳性与肝癌的发病密切相关，因此我们利用液相芯片技术对上述3项指标联合检测，开发出可用于健康体查、早期发现肿瘤的诊断试剂。在本研究中制备了单克隆抗体交联微球以及生物素标记抗体，采用双抗体夹心法同时定量测定人血清中的CEA、AFP、HBsAg。其检测范围达到3.4个对数值以上，CEA、AFP的最低检测限也远低于CLIA，这就保证了高浓度和低浓度血清标本即使采用同一稀释倍数也均可位于检测范围之内，省去了高浓度血清有时需要多次稀释的麻烦。该方法变异系数低于14%，具有较好的重复性，检测临床血清标本的灵敏度、特异度和准确度均较高，血清测值与其它方法（CLIA、TRFIA）之间呈显著的等级相关关系。液相芯片法仅需要1 ?滋L标本和3 h即可同时完成3项检测，较之CLIA或TRFIA大大节约了试剂、标本用量、人力以及操作时间，而且检测成本也比国外进口试剂更低，因此是一种优于传统检测技术的快速、高通量、多样本检测手段，今后若能实现自动化操作，必将具有广阔的临床应用前景。
本研究中对HBsAg的检测出现了4例假阴性结果。由于这4份血清标本的TRFIA测值均低于5 ng/mL，因此我们认为假阴性结果可能与标本稀释25倍后待测物浓度低于该方法的最低检测限有关。液相芯片法与TRFIA检测HBsAg的结果相关性稍差可能是因为TRFIA的线性范围较窄（0～150 ng/mL），而部分血清标本中的HBsAg水平大大高于该范围，因此对于这些标本来说，TRFIA的测值可能不太准确。下一步我们将筛选具有高亲和力的HBsAg抗体，以进一步提高HBsAg的检测灵敏度。
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