不同序贯的西妥昔单抗与化疗药物联合对ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２细胞的增殖抑制作用
【摘要】 观察不同序贯的西妥昔单抗（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）与化疗药物联合对人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２的增殖抑制作用，并分析其意义。 【方法】 浓度递增的ｃｅｔｕｘｉｍａｂ和表柔比星、奥沙利铂、泰素、伊立替康四种化疗药物分别按照不同给药序贯联合作用于ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２细胞，使用细胞计数试剂盒ＣＣＫ-８检测不同给药序贯的药物对ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２细胞的增殖抑制作用，利用生物学软件Ｃａｌｃｕｓｙｎ不同给药序贯时ｃｅｔｕｘｉｍａｂ和化疗药物的半数抑制浓度（ＩＣ５０）的变化，计算其作用的协同系数（ＣＩ）。 【结果】 Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ和化疗药物联用对ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２细胞的增殖抑制作用受给药序贯影响：ｃｅｔｕｘｉｍａｂ先于化疗药物给药，两者的ＩＣ５０较单用时降低，但是ＣＩ值均大于１，两者之间为拮抗效应；ｃｅｔｕｘｉｍａｂ后于化疗药物给药，两者的ＩＣ５０较单用时降低更为明显，且ＣＩ值均小于１，两者之间具有较明显的协同效应。 【结论】 Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ与化疗药物联用对肝癌细胞的增殖具有协同抑制作用，较佳的给药序贯是化疗药物先于ｃｅｔｕｘｉｍａｂ给药，能获得明显的协同效应，这有助于临床用药时降低药物剂量，减少毒副作用。
【关键词】 肝肿瘤 西妥昔单抗 联合化疗 表皮生长因子受体
Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｏｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＨｅｐＧ２ ａｎｄ Ｂｅｌ-７４０２ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｉｔｈｅｒ ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ，ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ， ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｏｒ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ， ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｃｈｅｄｕｌｅ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇｓ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（５～５００ ｍｇ／ｍＬ）ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｗｉｔｈ ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ（０．０２５～２．５ μｍｏｌ／Ｌ）， ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ（０．５～５０ μｍｏｌ／Ｌ）， ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（０．００１～０．１ μｍｏｌ／Ｌ） ｏｒ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（０．０５～５ μｍｏｌ／Ｌ） ｗｅｒｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｅｄ ｔｏ ＨＣＣ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ＨｅｐＧ２ ａｎｄ Ｂｅｌ-７４０２ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ， ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ＨｅｐＧ２ ａｎｄ Ｂｅｌ-７４０２ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＣＫ-８ ａｓｓａｙ， ｔｈｅ ＩＣ５０ ａｎｄ ＣＩ ｏｆ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ａｎｄ ｅｉｔｈｅｒ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇ ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】 Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇ ｗｉｔｈ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｃａｕｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ＨｅｐＧ２ ａｎｄ Ｂｅｌ-７４０２ ｃｅｌｌｓ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ ＩＣ５０ ｏｆ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｗｈｅｎ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ＣＩ ｖａｌｕｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ＞１， ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ａｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ｉｎ ｃｏｎｔｒａｓｔ， ｗｈｅｎ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗａｓ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ， ｔｈｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ ＩＣ５０ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｍｏｒｅ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ ａｎｄ ｔｈｅ ＣＩ ｖａｌｕｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ＜１，ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ】 Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇｓ ｃａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ＨｅｐＧ２ ａｎｄ Ｂｅｌ-７４０２ ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｓ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ， ｉｔ ｃａｎ ｏｂｔａｉｎ ｏｂｖｉｏｕｓ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｄｕｃｅ ｔｏ ｌｅｓｓ ｄｏｓｅｓ ａｎｄ ｍｉｌｄｅｒ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｉｖｅｒ ｎｅｏｐｌａｓｍ； ｃｅｔｕｘｉｍａｂ； ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ； ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
原发性肝癌起病隐匿，出现症状后进展迅速，患者就诊时多已届晚期失去手术根治机会，其总体５年生存率不足３０％。对于局部进展（肝内播散或门静脉癌栓）或合并远处转移的晚期肝癌尚缺乏有效的手段［１］。传统的全身化疗效果不理想，虽然所有上市的化疗药物都曾经试用于肝癌的治疗，但是客观缓解率最多不超过２０％。加之传统的化疗药物往往具有选择性差，毒性大等缺点，更限制了在肝癌患者中的应用［２］。随着对各种细胞表面分子与恶性肿瘤发生关系的研究不断深入，研究者发现表皮生长因子受体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）在许多肿瘤细胞中，如肺癌、结肠癌、头颈部鳞癌等的细胞表面能检测到异常的高表达，并常与恶性肿瘤的预后不良、早期复发转移、化疗抗拒等直接相关［３-５］。西妥昔单抗（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）是新近开发的靶向ＥＧＦＲ的单克隆抗体，在多种恶性肿瘤如头颈部鳞癌、结直肠癌等的治疗中，ｃｅｔｕｘｉｍａｂ单用或与传统化疗方案联合，取得了令人鼓舞的效果［５-７］。已有研究提示肝癌组织和癌旁肝组织中存在ＥＧＦＲ的高表达［８，９］，提示ＥＧＦＲ及其信号通路在肝癌的发生发展中可能具有重要的作用。目前国内外对于靶向ＥＧＦＲ药物与化疗药物联合用于治疗肝癌的报道极少，本研究通过观察ｃｅｔｕｘｉｍａｂ与化疗药物的不同给药序贯对人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２的增殖抑制作用，探讨其对肝癌细胞的化疗增敏效果与给药序贯的关系，为寻找优化的治疗序贯并进一步运用于肝癌患者的临床治疗提供实验依据。
１ 材料与方法
１．１ 药品与试剂
西妥昔单抗（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）购自德国默克公司，表柔比星（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）购自美国辉瑞公司，奥沙利铂（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）购自法国赛诺菲安万特公司，泰素（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）购自美国施贵宝公司，伊立替康（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）购自英国安万特公司，ＣＣＫ-８细胞计数试剂盒（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ-８）购自日本同仁化学研究所，ＲＰＭＩ Ｍｅｄｉｕｍ １６４０培养液、１００ ｍＬ／Ｌ新生小牛血清、含１００ Ｕ／ｍＬ青霉素和１００ ｍｇ／Ｌ链霉素的双抗、２．５ ｇ／Ｌ胰酶溶液购自美国Ｇｉｂｃｏ公司。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ为２ ｍｇ／ｍＬ的溶液，泰素为６ ｍｇ／ｍＬ的溶液，表柔比星、奥沙利铂、伊立替康为粉剂，以上药物均使用ｐＨ为７．２的ＰＢＳ溶液稀释至目标浓度。
１．２ 细胞株及培养方法
人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２，Ｂｅｌ-７４０２由中山大学肿瘤防治中心实验研究部提供。细胞培养于含１００ ｍＬ／Ｌ新生小牛血清、１００ Ｕ／ｍＬ青霉素和１００ ｍｇ／Ｌ链霉素的ＲＰＭＩ-１６４０培养液中，置于３７ ℃、ＣＯ２分压为５％（体积百分数）、湿度８５％的恒温培养箱中培养，每３ ～ ４ ｄ传代１次，取对数生长期细胞进行实验。
１．３ 体外ＣＣＫ-８细胞增殖抑制实验
１．３．１ 细胞接种
取对数生长期的ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２细胞，经２．５ ｇ／Ｌ 胰酶溶液充分消化后分别使用含１００ ｍＬ／Ｌ 新生小牛血清、１００ Ｕ／ｍＬ 青霉素和１００ ｍｇ／Ｌ 链霉素的ＲＰＭＩ-１６４０培养液稀释成单细胞悬液，ＨｅｐＧ２细胞密度为３ × １０４个／ｍＬ，Ｂｅｌ-７４０２细胞密度为５ × １０４个／ｍＬ，接种于９６孔培养板，接种过程细胞悬液保持吹打和晃动使细胞分布尽量均匀。每孔加入细胞悬液１００ μＬ，使每孔中ＨｅｐＧ２细胞为３ ０００个，Ｂｅｌ-７４０２细胞为５ ０００个，空白对照孔加入１００ μＬ不含小牛血清的培养液，置于３７ ℃、体积分数５％的ＣＯ２、８５％湿度的恒温培养箱中培养２４ ｈ，使细胞贴壁生长后，更换新培养基。
１．３．２ 药物分组及加药方法
实验设空白对照组、细胞对照组、单药处理组（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、表柔比星、奥沙利铂、泰素、伊立替康）；序贯处理组按照不同加药序贯，又分为序贯处理组１（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ＋化疗药物组）和序贯处理组２（化疗药物＋ｃｅｔｕｘｉｍａｂ组），每组中每一药物浓度各设３个复孔。
空白对照组在铺孔时用１００ μＬ培养液代替细胞悬液，细胞对照组和药物处理组铺孔时加入１００ μＬ的细胞悬液，经２４ ｈ细胞贴壁后，更换新培养液。加药时空白对照组加入２００ μＬ培养液；细胞对照组加入１００ μＬ培养液 ＋ １００ μＬ的ＰＢＳ溶液（ｐＨ ７．２），单药处理组加入１００ μＬ培养液、１００ μＬ药物溶液，使每孔中液体终体积为２００ μＬ；序贯处理组１先加入１００ μＬ培养液和１００ μＬ的ｃｅｔｕｘｉｍａｂ溶液，培养４８ ｈ后，小心倒出培养板内液体，每孔内加入２００ μＬ的ＰＢＳ溶液轻微振荡洗去残留于孔壁的药物，重复３次，加入１００ μＬ培养液和１００ μＬ的化疗药物，继续培养２４ ｈ；序贯处理组２先加入１００ μＬ培养液和１００ μＬ的化疗药物培养２４ ｈ，照前法洗涤培养板去除残留药物后，加入１００ μＬ培养液和１００ μＬ的ｃｅｔｕｘｉｍａｂ，继续培养４８ ｈ。
实验药物单用时选取７个依次递增的浓度处理细胞，浓度分别为ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（５ ～ ５００ ｍｇ／ｍＬ），表柔比星（０．０２５ ～ ２．５ μｍｏｌ／Ｌ）、奥沙利铂（０．５～５０ μｍｏｌ／Ｌ）、泰素（０．００１ ～ ０．１ μｍｏｌ／Ｌ）、伊立替康（０．０５ ～ ５ μｍｏｌ／Ｌ）；序贯处理时，加入孔内的两药浓度亦同时递增，其浓度比例保持恒定。
１．３．３ 实验方法
单药处理组经ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ４８ ｈ、化疗药物２４ ｈ作用后，序贯处理组按照不同序贯的ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ４８ ｈ和化疗药物２４ ｈ作用后，于培养板每孔内加入１０ μＬ的ＣＣＫ-８溶液，３７ ℃下孵育０．５ ｈ，全自动酶标仪以４９０ ｎｍ和５４０ ｎｍ双波长测定各孔吸光度（Ａ值），实验重复进行３次，取３次计算所得抑制率的均数输入Ｃａｌｃｕｓｙｎ软件计算结果。
１．３．４ 计算方法
①各组细胞存活率（％）＝（该药物处理组Ａ值－空白对照组Ａ值）／（细胞对照组Ａ值－空白对照组Ａ值）×１００％；②细胞增殖抑制率（％）＝１００％－该组细胞存活率；统计学处理根据Ｃｈｏｕ等［１０］药物协同作用中效原理，使用生物软件ＣａｌｃｕＳｙｎ计算ｃｅｔｕｘｉｍａｂ作用４８ ｈ和化疗药物作用２４ ｈ对ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２细胞的ＩＣ５０（５０％ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，半数抑制浓度）及９５％可信区间、不同序贯联用时ｃｅｔｕｘｉｍａｂ和化疗药物的ＩＣ５０的变化、不同序贯联用时实验浓度的ｃｅｔｕｘｉｍａｂ和化疗药物的ＣＩ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ， 协同系数）及９５％可信区间以及ｃｅｔｕｘｉｍａｂ和化疗药物在各自ＩＣ５０时的ＣＩ值。
２ 结 果
２．１ 单药ｃｅｔｕｘｉｍａｂ和化疗药物对ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２细胞的作用
单独应用ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ４８ ｈ和化疗药物２４ ｈ作用于ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２细胞，得到各自的ＩＣ５０及其９５％可信区间见表１。
２．２ 不同序贯的ｃｅｔｕｘｉｍａｂ和化疗药物联用对
ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２细胞的ＩＣ５０
ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２细胞经同样的ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ４８ ｈ和化疗药物２４ ｈ作用，不同的给药序贯，药物的ＩＣ５０呈现不同的变化：序贯处理组１内各组药物的ＩＣ５０较单用时有所降低（除ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ联用ｃｅｔｕｘｉｍａｂ后对Ｂｅｌ-７４０２的ＩＣ５０稍增大外）；序贯处理组２内各组药物的ＩＣ５０均较单用时和序贯处理组１明显降低（表２）。
２．３ 不同序贯的ｃｅｔｕｘｉｍａｂ和化疗药物对ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２细胞的协同系数
ＣＩ值是评价两种药物之间相互作用的指标，特别是两药各自在ＩＣ５０时的ＣＩ值，是衡量其相互作用的性质和强度的客观指标。结果表明：按照不同的给药序贯联合ｃｅｔｕｘｉｍａｂ和化疗药物作用于ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２细胞，无论是实验选用的实际药物浓度之间（图１－４），还是在各自的理论ＩＣ５０之间（表３），序贯处理组１中ｃｅｔｕｘｉｍａｂ和化疗药物的ＣＩ值均大于１，序贯处理组２中ｃｅｔｕｘｉｍａｂ和化疗药物的ＣＩ值均小于１，说明ｃｅｔｕｘｉｍａｂ先于化疗药物作用，虽然各自的ＩＣ５０均较单用时降低，但是ＣＩ值提示此时药物之间是拮抗效应；而化疗药物先于ｃｅｔｕｘｉｍａｂ作用，则表现出明显的协同效应。
３ 讨 论
ＥＧＦＲ是生长因子受体家族的重要成员之一［３］， 为原癌基因ｃｅｒｂＢ-１（ＨＥＲ-１）编码的、含５３个氨基酸残基、相对分子质量１７０ × １０３ ｋｕ的跨膜受体蛋白。由膜外配体结合区域、跨膜转换区域和具酪氨酸激酶活性的胞内效应区域三部分组成，广泛分布于多种人体正常细胞表面。ＥＧＦＲ 在与其配体结合后可以参与细胞生长、增殖和凋亡等多种重要功能，在正常的细胞生理过程中发挥十分重要的调控作用。在包括肝癌在内的多种恶性肿瘤细胞表面可以检测到ＥＧＦＲ的异常高表达［１１］，并与肿瘤的多种恶性生物学特性：如预后不良、短期复发，特别是放化疗抗拒等直接相关［３-５］。
Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ是人鼠嵌合型的ＥＧＦＲ单克隆抗体［１２］，其主要的作用机制为：与配体竞争ＥＧＦＲ分子胞外部分的特殊结合位点，阻断ＥＧＦＲ的激活，从而阻断其下游一系列与细胞生长、增殖、抗凋亡相关的酶促级联信号转导途径。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ单用或与化疗药物组成联合方案已在多种肿瘤如头颈癌、肺癌、结肠癌的临床中显示了较好的疗效［６，７］，并成为第一个经美国ＦＤＡ批准用于已发生转移的晚期直肠癌患者治疗的单克隆抗体药物。
肝细胞肝癌对传统的化疗药物不敏感［１，２］，这使得晚期肝癌的治疗成为临床上的棘手问题。本研究中，我们选用作用机制不同的化疗药物（表柔比星、奥沙利铂、泰素、伊立替康），按照不同的给药序贯分别联合ｃｅｔｕｘｉｍａｂ作用于人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ-７４０２。结果表明，序贯处理组１中ｃｅｔｕｘｉｍａｂ和化疗药物的ＩＣ５０值都较单用时降低，但是两药在各自ＩＣ５０时的ＣＩ值均大于１；序贯处理组２中的两药ＩＣ５０值较单用和序贯处理组１更低，且两药在各自ＩＣ５０时的两药ＣＩ值均小于１。根据Ｃｈｏｕ等［１０］药物量效原理（两药联用时ＣＩ ＞ １为拮抗，ＣＩ＝１为相加，ＣＩ ＜ １为协同，ＣＩ值越小，协同效应越强），说明当ｃｅｔｕｘｉｍａｂ先于化疗药物给药时，两者之间为拮抗效应，而同样的两药联合，给药序贯变为化疗药物先于ｃｅｔｕｘｉｍａｂ给药时，两者产生了明显的协同效应。由于本实验选用的四种化疗药物作用机制不同且相互间无交叉，说明这一现象并非ｃｅｔｕｘｉｍａｂ与特定种类的化疗药物联用时出现，而是具有较为普遍的意义。
国外学者的实验也有类似的结果，如Ｍｏｒｅｌｌｉ等［１３］将ｃｅｔｕｘｉｍａｂ和泰素、顺铂、卡铂联合作用于人食管鳞癌细胞ＫＹＳＥ３０；Ｘｕ等［１４，１５］将Ｉｒｅｓｓａ和奥沙利铂、伊立替康联合作用人结肠癌细胞ＨＴ-２９和ＬｏＶｏ等。这些研究表明，ＥＧＦＲ靶向药物与传统化疗药物联合时，必须按照一定的序贯（即化疗药物先于靶向药物给药），才能取得较为明显的协同效应。分析这一现象的原因，可能是经过靶向药物作用后的肿瘤细胞，其增殖速度变慢，细胞周期停滞，从而对化疗药物的敏感性下降；而先经过化疗药物作用后的肿瘤细胞，其ＤＮＡ受到不同程度的损伤，对随后的靶向药物阻断ＥＧＦＲ信号转导途径产生的细胞功能损害耐受力下降，细胞坏死或凋亡进一步增加。
以上结果证实：ｃｅｔｕｘｉｍａｂ与化疗药物联用对肝癌细胞的增殖具有协同抑制作用，较佳的给药序贯应是化疗药物先于ｃｅｔｕｘｉｍａｂ给药，能获得明显的协同效应，有助于临床用药时降低药物剂量，减少毒副作用，这也为进一步的肝癌动物模型和人体临床实验提供了新的思路和理论。
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