三七总皂甙抗病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纤维化作用及其机制的研究
作者：程志清 徐百鸿 窦丽萍 刘旺 王娟
【摘要】 ［目的］探讨三七总皂甙（PNS）抗病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纤维化的作用及其可能的机制。［方法］通过反复感染柯萨奇病毒建立病毒性心肌炎慢性期小鼠模型，采用HE和VG染色观察心肌病变和纤维增生情况，采用病理检验方法对心肌胶原容积分数（CVF）和心肌血管周围胶原面积（PVCA）进行检测，并采用免疫组化法及RT?PCR法检测心肌中TGF?β1蛋白及其mRNA表达水平。［结果］病毒性心肌炎慢性期模型组小鼠心脏出现明显心肌纤维化，与正常组比较，CVF和PVCA均显著增加（P<0.01），模型组心肌中TGF?β1蛋白及其mRNA表达水平均较正常组明显升高，与正常组比较，差异有显著性意义（P<0.01）；三七总皂甙组可以减轻心肌病变程度，CVF和PVCA示三七总皂甙各治疗组心脏中胶原比模型组均明显减少，并且三七总皂甙治疗组心肌中TGF?β1蛋白及其mRNA表达水平较模型组下降。［结论］三七总皂甙能下调病毒性心肌炎慢性期TGF?β1的表达，抑制心肌胶原的增生，提示其抗病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用可能部分通过抑制PDGF?BB过度表达有关。
【关键词】 三七总皂甙；心肌纤维化；转化生长因子；病毒性心肌炎
Abstract： ［Objective］To study the mechanisms and effects of panax notoginsenosides(PNS) on myocardial fibrosis in chronic viral myocarditic(VMC) mice.［Methods］The model mice with VMC at chronic status were established by repetitive infection of Coxsckievirus B3m(CVB3m).Heart changes of myocardium and collagen hyperplasia were observed by HE and VG stain.Collagen volume fraction (CVF) and perivascular circuferential area (PVCA) were examined by pathological examination with computed processing.Myocardium TGF?β1 was detected by immunohistochemical method and mRNA expression of TGF?β1 was analyzed by Reverse transcription polymerase chain reaction (RT?PCR) method.［Results］Marked myocardial fibrosis was observed in chronic VMC model group.Compared with blank group，the index of CVF and PVCA was increased significantly（P<0.01）.TGF?β1 immunohistochemical staining and TGF?β1 mRNA levels in VMC model group was significantly increased than the blank group(P<0.01);Compared with chronic VMC model group，pathological changes of myocardium relieved in PNS treated group.The index of CVF and PVCA was decreased in PNS treated group.Further，TGF?β1 immunohistochemical staining and TGF?β1 mRNA levels in PNS?treated group were decreased than chronic VMC model group.［Conclusion］PNS inhibit TGF?β1 protein and mRNA over?expression in myocardium of chronic VMC mice，and reduce collagen synthesis,suggesting that its mechanism may be partly inhibiting TGF?β1 protein and mRNA over?expression in myocardium.
Key words: panax notoginsenosides;myocardial fibrosis;TGF?β1;viral myocarditis
病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）慢性期心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）的发病机理复杂，目前尚未发现针对性的治疗药物。现在较为肯定的具有抗心肌纤维化的药物有血管紧张素转化酶抑制剂ACEI［1?2］,醛固酮拮抗剂［3］、钙拮抗剂等［4］，但是由于作用单一、不良反应及价格等因素影响了临床应用。
因此很多学者开始广泛研究中药对病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用，并取得了一些进展。三七总皂甙（Panax notoginsenosides，PNS）是五加科人参属植物三七根部提取的有效成分，研究发现PNS不但可以抑制组织纤维化的作用［5?7］，而且还具有保护心肌［8］、抗心率失常［9］及调解免疫［10］等作用。上述作用强烈提示PNS可能是治疗VMC慢性期心肌纤维化的理想药物，但目前还没有得到直接的实验和临床支持，国内外也没有相应的报道。本实验将观察PNS对VMC慢性期心肌纤维化的干预作用及对TGF?β1表达的影响，探讨PNS抗病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用及其机制。
1 材料和方法
1.2 材料 (1)病毒:柯萨奇 B3病毒(Nancy株，Hep?2细胞上测定TCID50=10-5)，由复旦大学医学院附属中山病毒性心肌炎重点实验室提供。(2)动物 雄性Balb/c小鼠，5～6周龄，体重16～18g。购自院上海实验动物中心。(3)药物与试剂 PNS由云南玉溪市维和制药有限公司提供；免疫组化检测试剂盒EnVisionTM Two?Step Histostaining Reagent Lot:00002568101为丹麦DAKO公司的产品；TGF?β1为Rabbit来源的多克隆抗体，工作浓度均为1∶50，为武汉博士德生物公司的产品；Trizol及逆转录试剂盒：购于上海Sangon生物工程技术公司；PCR试剂盒：购于大连宝生物工程有限公司；引物：上海Sangon生物工程技术公司合成。
1.2 方法
1.2.1 VMC慢性期心肌纤维化模型的建立、分组及给药 雄性BALB/c小鼠88只，随机先分出正常对照组(N组)8只，腹腔注射无病毒Eagle’sMEM液0.1ml/只。其余80只腹腔接种含1∶2000的100TCID50加CVB3的Eagle’sMEM液0.1ml／只，以后每2周注射1次，共3次(每次病毒液浓度是前一次的2倍，注射液体量不变)，以建立病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的小鼠模型，60天后存活小鼠随机分组并开始给药。分组：模型对照组：M组；三七总皂甙高剂量治疗组：T1组；三七总皂甙中剂量治疗组：T2组；三七总皂甙低剂量治疗组：T3组。给药方式：N组和M组以蒸馏水0.2mL／只灌胃作为安慰用药，T1组每只小鼠以每天0.6g／kg的剂量给药0.2ml，T2组以每只小鼠每天0.4g／kg的剂量给药0.2ml，T3组以每只小鼠每天0.2g／kg的剂量给药0.2ml。每日灌胃1次，用药45天后处死动物作检测。
1.2.2 标本采集 脱颈椎处死小鼠后，立即取心脏分为两部分，第一部分：取心尖、右心室（预实验发现右心室病变较左心室重）和室间隔部，放入预先消毒和DEPC处理过的冻存管中立即置于液氮中，用作RT?PCR实验。第二部分：剩余部分心肌（保证有左右心室和室间隔）立即放在10%中性缓冲福尔马林（pH 7.4）固定液中固定，做石蜡包埋和切片。
1.2.3 HE与VG染色及CVF、PVCA测定 取右心室中段横断面心肌组织，常规固定、包埋和制片，进行HE染色和VG染色，以清晰显示心肌细胞和胶原组织，光镜下观察组织形态学改变。应用HPIAS1000型图象分析仪，在VG染色下测量心肌容积分数(CVF)和心肌血管周围胶原面积(PVCA)。通过灰度调节来区别胶原和非胶原成分。方法：CVF=胶原面积/总面积，其中胶原面积不包含血管周围胶原面积。随机分析5个视野，取其均值作为该部位的CVF。PVCA=心室壁内小动脉管腔周围胶原面积/动脉管腔面积。每一标本取4根壁内小动脉横切面进行测量，取其均值作为该部位的PVCA。
1.2.4 心肌组织TGF?β1的检测 取石蜡切片常规脱蜡入水，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10分钟，PBS 洗5分钟×3次，滴加一抗，4℃过夜。TGF?β1为Rabbit来源的多克隆抗体，工作浓度为1∶50，为武汉博士德生物公司的产品；PBS冲洗，5分钟×3次，滴加山羊抗兔IgG抗体?HRP多聚体，37℃孵育40min，PBS冲洗，5min×3次，DAB显色液显色1-3min，显微镜下控制反应，自来水冲洗终止反应，Harris苏木素液复染细胞核1min，95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。利用武汉同济千屏影像工程公司 HPIAS?1000病理图文分析系统采集图像，半定量分析TGF?β1的表达情况。即对每张切片的心肌阳性细胞的着色强度采用HPIAS?1000病理图文分析系统进行测量。每张切片随机采集5个视野（×200倍），经过该系统自动分析获得该5个视野的5个平均光密度值，经计算机平均后代表该标本的染色强度，然后进行整理及统计分析。
1.2.5 心肌组织TGF?β1mRNA含量测定 Trizol一步法抽提总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见5S、18S和28S三条带,说明RNA完整没有降解，可作为逆转录反应的模板。通过逆转录合成cDNA。取RNA抽提液2μL加98μL无RNA酶去离子水混匀，Du?640紫外分光光度仪测OD260/OD280，检测核酸浓度，计算核酸量。TGF?β1上游引物为5’?GAGGGGGAGGAGGAGTGGGA?3’，下游引物为5’?CCGGGTAGCGATCGAGTGTC?3’，产物长度169bp；GAPDH 上游 5’ GAGGCCGGTGCTGAGTATGT 3’，下游 5’ CTTCTGGGTGGCAGTGATGG 3’，产物长度294bp；TGF?β1的反应条件：95℃，5分，预变性；94℃，30秒，变性；61℃，20秒，退火；72℃，20秒，延伸；72℃，7分，终末延伸；35个循环，4℃保温；GAPDH的反应条件：95℃，5分，预变性；94℃，30秒，变性；60℃，20秒，退火；72℃，30秒，延伸；72℃，7分，终末延伸；35个循环，4℃保温。以基因GAPDH作为内参照，经1.5%琼脂糖凝胶（含EB）电泳，紫外光下拍照，电泳结果用Syngene成像分析系统（英国）进行扫描及灰度分析，对阳性电泳条带进行吸光度峰值下面积积分，每一样本以TGF?β1和GAPDH条带吸光度积分的比值作为样本的表达的量。
1.3 统计学方法 实验数据以均数±标准差（x±s）表示，应用 SPSS11.5统计软件包进行统计分析处理，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较方差齐性时采用最小有意义差异法（LSD）检验，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。
2 结果
2.1 一般结果 首次感染柯萨奇病毒后的小鼠第三天开始出现耸毛、懒动、拱背等情况，第二次，第三次感染柯萨奇病毒后，小鼠也出现耸毛、懒动、拱背等情况，但反应较前减轻，整个造模过程小鼠共死亡20只，死亡率25%。
2.2 各组小鼠心肌组织病理改变情况 N组小鼠心肌细胞呈短圆柱状，细胞结构清晰，胞核卵圆形，清晰可见，肌纤维排列紧密有序，心肌横纹清晰，未见肌纤维溶解、单核细胞浸润及心肌细胞坏死；心肌胶原纤维主要分布在血管周围，心肌细胞间有少量的胶原纤维；M组心肌细胞排列紊乱，胞浆较正常色淡，心肌横纹不清，炎症细胞少许可见，可见钙化灶，病变以右心室明显；而且M组除血管周围有胶原纤维外，心肌细胞间有大量纵横交错的胶原纤维，排列紊乱；各治疗组心肌细胞的病变要较模型对照组轻，且胶原纤维的量也少于模型对照组，其中以T1组病变程度减轻最为明显。
2.3 CVF与PVCA的测定结果 各组CVF与PVCA的测定结果显示，模型组心肌胶原容积分数(CVF)和心肌血管周围胶原面积(PVCA)与正常组比较均明显升高，统计学分析差异有显著性，三七总皂甙高、中剂量组CVF和PVCA和模型组比较均有明显降低，统计学分析差异有显著性，三七总皂甙低剂量组CVF和PVCA和模型组比较降低，统计学分析差异无显著性（表1）。
表1 各组CVF和PVCA测定值的比较（略）
与正常组比较,*P<0.01；与模型组比较,△P<0.05
2.4 各组小鼠心肌组织TGF?β1表达的变化 TGF?β1在心肌细胞的胞浆及间质内表达，在N组小鼠的心肌胞浆可见较少量黄色颗粒物质，TGF?β1表达呈弱阳性（图1）；M组小鼠心肌细胞胞浆内布满棕黄色颗粒状物质，TGF?β1呈高表达（图2），各治疗组TGF?β1表达较M组表达均明显减少，统计学分析差异显著性，其半定量分析结果见表2（图3、4、5）。
2.5 各组小鼠心肌组织TGF?β1mRNA表达的变化：N组TGF?β1mRNA表达低；M组TGF?β1mRNA表达较N组明显增高（P<0.01）；三七总皂甙各治疗组TGF?β1mRNA表达与M组比表达降低，但统计学分析差异无显著性(见表2、图6)。
表 2 各组小鼠心肌组织TGF?β1表达的变化（略）
与正常组比较,*P<0.01；与模型组比较,△P<0.05；与模型组比较,★P>0.05
图1 正常组TGF?β1免疫组化结果（×200）（略）
图2 模型组TGF?β1免疫组化结果（×200）（略）
图3 PNS高剂量治疗组TGF?β1结果（×200）（略）
图4 PNS中剂量治疗组TGF?β1免疫组化结果（×200）（略）
图5 PNS低剂量治疗组TGF?β1免疫组化结果（×200）（略）
图6 心肌组织TGF?β1mRNA的表达（略）
3 讨论
病毒性心肌炎慢性期的主要病理变化为心肌纤维化［11］，心肌纤维化是指心肌间质中胶原浓度显著升高或胶原容积分数(CVF)显著高于正常值。而胶原的过度沉积对心脏的功能会产生一系列的影响，可引起心脏僵硬度增加，舒张功能障碍及心肌电传导异常等病理变化，是出现心力衰竭、心律失常、心脏性猝死等并发症以及由心肌炎到心肌病的主要原因。因此预防及控制心脏间质胶原增生是病毒性心肌炎慢性期治疗的重要环节。
本研究利用反复注射CVB的方法复制病毒性心肌炎小鼠心肌纤维化的模型，用PNS进行治疗。发现用药45天后，模型对照组小鼠心脏组织中胶原积累明显增加，而三七总皂甙能明显减轻心脏组织中胶原的沉积，提示三七总皂甙具有抗病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的作用。
心肌中胶原的过度沉积是由于胶原的生成大于降解的结果，胶原的生成和降解之间的动态平衡涉及一系列的调控因素，其中TGF?β1是一种细胞外间质的重要调节因子，可以促进间质胶原的合成，抑制胶原的降解。心肌中TGF?β1的分泌，主要由心肌细胞和心肌成纤维细胞分泌。研究发现 TGF?β1以旁分泌/自分泌方式在心肌纤维化过程中起重要作用，其可刺激心脏成纤维细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达，也可调节其胶原酶活性，减少胶原降解［12］。并且有研究发现病毒性心肌炎慢性期胶原的沉积增多与TGF?β1的持续高表达有着密切的关系［13］。韩福生等也证明病毒性心肌炎慢性期TGF?β1可通过上调TIMP?1mRNA的表达，使TIMP／MMP比值增加，从而导致胶原在代谢中降解不足，使心肌间质胶原纤维含量增加发生过度沉积。因此可见抑制病毒性心肌炎慢性期心肌中TGF?β1的持续高表达是治疗病毒性心肌炎慢性期心脏间质纤维化的重要途径之一［14］。
此次实验结果显示，模型组TGF?β1的表达水平均高于正常组，提示病毒性心肌炎慢性期心肌中TGF?β1的高表达可能是病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌中间质过度沉积的原因之一，而三七总皂甙治疗组TGF?β1的表达水平明显低于模型组，提示三七总皂甙可以在一定程度上通过下调小鼠心肌组织中TGF?β1的表达来抑制VMC慢性期心肌胶原的增生，并且这种作用有随着剂量递增而增强的倾向。但三七总皂甙具体经什么途径抑制TGF?β1的表达，目前尚不清楚，有待于进一步深入研究。
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