肿瘤抗原MAGE

              作者：张秀敏，隋延仿，罗二平，李增山， 黄亚渝，司少艳

【Abstract】AIM：  To predict the HLAA2restricted cytotoxic T lymphocyte (CTL) epitopes of tumor antigen MAGEA subfamily so as to provide appropriate CTL epitope for tumor immunotherapy. METHODS:  The CTL epitopes of tumor antigen MAGEA subfamily were predicted by SYFPEITHI prediction method combined with the polynomial method. The amino acid sequence and the candidate CTL epitopes of the member of MAGEA subfamily were analyzed by DNAstar software. RESULTS:  Fifty HLAA2restricted CTL epitope candidates (nonamers) derived from the tumor antigen MAGEA subfamily were selected and some epitopes were highly similar or completely identical. CONCLUSION:  The combination of SYFPEITHI prediction method and polynomial method can improve the prediction efficiency and accuracy. Analyzing the homology of CTL epitopes and finding common epitopes help to develop some promising antigen peptide tumor vaccines..

　　【Keywords】  antigens, neoplasms; MAGEA subfamily; Tlymphocytes, cytotoxic; epitopes; forecasting; sequence analysis

　　【摘要】目的：  预测肿瘤抗原MAGEA亚家族的HLAA2限制性CTL表位,为肿瘤选择合适的CTL表位提供依据.方法： 用SYFPEITHI超基序法远程预测系统和量化基序多项式结合的预测方法进行HLAA2限制性CTL表位预测,采用DNAstar软件提供的蛋白质核酸序列编辑、分析工具，对MAGEA亚家族成员进行CTL序列同源性分析.结果： 共预测出了 50个HLAA2限制性CTL表位，且部分CTL表位高度相似或一致.结论： SYFPEITHI超基序法和量化基序多项式法结合的预测方法是一种高效、准确的表位预测方法，结合CTL 表位的同源性分析，可为肿瘤治疗性疫苗的制备中选择合适的CTL表位提供依据.

　　【关键词】 抗原，肿瘤; MAGEA亚家族; T淋巴细胞，细胞毒性; 表位; 预测；序列分析

　　0引言

　　肿瘤抗原是指细胞在癌变过程中出现的特异性抗原物质的总称，是肿瘤治疗的主要靶分子.MAGE作为人类肿瘤特异性抗原，在肿瘤生物治疗及肿瘤疫苗的研制方面发挥着重要作用.近年研究发现在不同肿瘤或同一肿瘤中MAGEA亚家族成员的表达上存在差异［1］，仅诱发针对单一MAGEA亚家族成员的CTL反应并不能杀伤所有肿瘤细胞.我们利用CTL表位预测的最新方法对MAGEA亚家族成员的HLAA2限制性CTL表位进行预测，并用DNAstar软件对预测出的CTL表位进行分析，旨在寻找其共有表位及相似表位，为进一步研制更具广谱性的肿瘤疫苗奠定基础.

　　1材料和方法

　　11材料

　　MAGEA家族序列: MAGE1，MAGE2，MAGE3，MAGE4，MAGE6，MAGE8，MAGE9，MAGE10，MAGE11，MAGE12编码蛋白氨基酸全长序列（由Genbank获得）.

　　12方法

　　121SYFPEITHI超基序法远程预测CTL表位我们拟预测由9个氨基酸残基组成的CTL表位，具体方法： 利用Intenet进入SYFPEITHI主页（tuebingen.de/uni/kxi），参照［2,3］介绍的方法，对MAGEA亚家族成员HLAA2限制性CTL表位进行远程预测.

　　122候选表位限制性抗原肽多项式方案分析当某残基R出现在某肽的第一位时,在不考虑其他肽序列的情况下,该残基对于整个肽与MHCI类分子的结合自由能提供了一个常量Ri,用在第I位为残基R大量多肽的抑制浓度(Inhibiting concentration , IC) IC50的负log10值的平均值来估计此常量［4］.分别将初步预测的九肽氨基酸残基对应的Ri值相加,选择分值大于选定阈值的抗原肽作为可能的候选肽.本研究选择阈值为-23.

　　123利用DNAstar软件对CTL表位进行同源性分析利用EqitSep程序对预测出的MAGEA家族成员的HLAA2限制性CTL表位的氨基酸序列进行编辑建立pro文档，然后利用MegAlign程序提供的Clustal序列对齐法进行 HLAA2限制性CTL表位比较分析.

　　2结果

　　21MAGEA亚家族CTL表位远程预测结果通过Internet网络采用SYFPEITHI法初步得到多条可能结合的九肽.分别选取MAGEA亚家族成员中预测分值最高的10条九肽为候选肽（Tab 1）.其预测分值均较高（Score>20）.表1人HLAA2 结合肽表位预测（略）

　　22候选表位限制性抗原肽多项式方案分析将初步预测得到的100条HLAA2限制性CTL表位抗原肽序列与以往报道的CTL表位比较，其中13条为已被证实的抗原肽［3,5-11］.我们对其余抗原肽采用多项式方案进行量化分析（Tab 1），将其多项式系数＜-23的抗原表位多肽筛除.共获得50条候选抗原表位.

　　23MAGEA亚家族HLAA2限制性CTL表位比较结果 对预测出的HLAA2限制性CTL表位分析比较，发现肿瘤抗原MAGEA亚家族成员的部分HLAA2限制性CTL表位高度同源或完全一致（Tab 2）.表2HLAA2限制性CTL表位序列（略）

　　3讨论

　　近年来，肿瘤治疗性疫苗迅速，由于肿瘤抗原MAGE在肿瘤组织中特异性表达，同时可以激活免疫系统，诱导产生特异性CTL，杀伤肿瘤细胞，而对正常组织细胞无损害，因此，以肿瘤抗原MAGE为基础的肿瘤疫苗是一种安全、有效的肿瘤生物治疗的方法.目前，有一些肿瘤抗原肽疫苗已进入Ⅱ期临床，并取得了很好的疗效，所以获得更多的MAGE CTL表位，对于肿瘤疫苗的制备十分重要.在我国HLAA2阳性人群比例较高［12］，因此，HLAA2限制性MAGE CTL表位的预测与鉴定更具现实意义.以往鉴定CTL表位的技术路线为：用酸洗脱法，将肿瘤细胞上与MHCI类分子结合的抗原肽洗脱下来，进一步分离、纯化并观察这些抗原肽在体外是否能诱导CTL反应；另一种方法是在未知肿瘤抗原的CTL表位时，利用合成重叠肽的方法分别诱导CTL的方法筛选 CTL表位.这些方法优点是覆盖面广，漏选的可能性小，但是繁琐、费时，而且常需合成大量的肽段，代价昂贵.

　　自从Boon小组从特异性CTL入手，首次成功分离人黑色素瘤抗原MAGE1以来，人们对MAGE家族的认识迅速.通过进一步研究发现： MAGE是由高度同源的多个成员组成的大家族，根据其基因位于X染色体的不同区域分为MAGEA，MAGEB， MAGEC，MAGED 4个亚家族［13］.由于MAGE的许多成员与肿瘤密切相关，引起人们广泛的关注.目前研究最多的是MAGEA亚家族.肿瘤抗原MAGEA亚家族位于Xq28上，长约45 kb，包含12个家族成员，除MAGE5与MAGE7为假基因外，编码蛋白均为最后一个外显子，由309~319个氨基酸残基组成.

　　本研究采用超基序法与多项式系数结合的方法，预测出了50个理论上与HLAA2分子有较高亲和力的九肽表位.在基于超基序法远程预测的100个表位中，有13条已被不同研究证实为HLAA2限制性CTL表位，这一结果证实抗原表位预测方法可靠，与实验方法获得的结果具有平行性.其他候选表位有待进一步体外实验筛选、鉴定.通过表位预测不仅可以克服费时、费力、费钱的缺点，减少确定CTL表位实验的盲目性，而且可以提高实验结果的预见性和成功率.之后，我们通过DNAstar分析软件提供的方法，对肿瘤抗原 MAGEA亚家族成员初步预测的HLAA2限制性CTL表位进行了分析，结果发现： MAGE2(271279)在相应区域与MAGE3，MAGE4，MAGE6，MAGE12序列同源性最高，MAGE3(112120)在相应区域与MAGE6，MAGE8，MAGE9及MAGE3(220228)在相应区域与MAGE2，MAGE6，MAGE11序列同源性也很高，且部分序列完全一致，其他HLAA2限制性CTL表位序列除MAGE10高度保守外也有一定的同源性或相似性.提示这些HLAA2限制性CTL表位经进一步免疫学鉴定后可望用于肿瘤性疫苗的设计研究.同时MAGE2的CTL表位271~279以及MAGE3 的271~279，220~280，112~120可作为共有表位.据报道，许多肿瘤在表达黑色素瘤抗原时往往不是单一表达，而是同时表达多种MAGEA亚家族抗原［14］.所以，通过HLAA2限制性CTL表位预测结合表位序列同源性分析，有利于在肿瘤治疗性疫苗中选择合适的CTL表位，同时利用共有表位制成的肽疫苗可同时杀伤表达不同MAGEA抗原的肿瘤细胞，为进一步研制更具广谱性的肿瘤抗原肽疫苗提供依据.

　　【】

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