人早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养

            作者：李富军，王雪萍，刘斌，李焰，李洁 

【Abstract】AIM： To prepare highly purified human trophoblast cells from human placentae at the first trimester of normal pregnancy for further study on the function of human placentae villi. METHODS:  A standard trypsinDNase dispersion method was used to isolate the trophoblast cells and cell purity was determined by immunostaining for markers of fibroblasts (antivimentin). The structural features were revealed by transmission electron microscopy. RESULTS:  The cell viability evaluated by trypan blue exclusion was greater than 90%. And light microscopic examination revealed that the cells were epitheliallike cells, with patchy spreading. The cells were positive for cytokeratin and negative for vimentin, indicating the absence of contaminating elements. Transmission electron microscopy revealed that the cells had fine structural features typical of trophoblasts. CONCLUSION:  The method, simple and easy to operate, can be used in studying the function of human placentae villi during pregnancy.

　　【Keywords】  trophoblast/cytology; cell culture; persons

　　【摘要】目的： 培养纯度较高的人绒毛膜滋养层细胞, 为胎盘绒毛在妊娠期间的作用及其机制研究提供细胞学基础.方法：  胰蛋白酶DNase消化法培养人绒毛膜滋养层细胞，间接免疫染色进行细胞纯度检测，透射电镜观察细胞内部结构.结果： 倒置显微镜下，可见细胞为上皮样细胞形态，呈片状铺展生长.细胞角蛋白染色阳性，波型蛋白染色阴性，表明不含污染细胞.透射电镜观察示所获细胞有典型滋养层细胞结构.结论： 该法简便易行，可获得合乎试验要求的人绒毛膜滋养层细胞.

　　【关键词】 滋养层/细胞学；细胞培养；人

　　0引言

　　人胎盘绒毛膜滋养层细胞对研究胎盘绒毛在妊娠期间的作用及其机制有很重要的生物学意义［1-8］.但由于在体研究受到各种因素的影响和限制，妨碍了对其功能的研究.体外培养人绒毛膜滋养层细胞，由于不受复杂的内环境的影响，可在人为条件下对细胞进行多方面的研究.因而对研究其作用及机制提供了一种较好的试验手段.国内外有关人绒毛膜滋养层细胞的离体培养方法，大多步骤繁琐，成本很高，不适于普通试验室推广应用［2-4，6-11］.我们采用胰蛋白酶消化法分离培养人绒毛膜滋养层细胞，并用免疫细胞化学法和透射电镜对其进行鉴定，以寻求一种简便实用的培养方法.

　　1材料和方法

　　11 材料

　　DMEM培养基和胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，DNase I购自华美生物工程公司，HEPES购自Promega 公司，抗角蛋白IgG、抗波型蛋白IgG购自DAKO公司，超敏SP试剂盒购自福州迈新生物工程有限公司，超级小牛血清购自杭州四季青生物制品研究所，DHank，S液自配，所有液体均高压消毒或过滤除菌. 6~10 wk人工流产胎盘绒毛组织由第四军医大学西京妇产科门诊手术室提供.

　　12方法

　　121人绒毛膜滋养层细胞的培养取妊娠6~10 wk、发育正常的流产新鲜胎盘组织，在无菌超净台内，用生理盐水冲洗3遍，去除血污，用眼科剪剪去蜕膜等物质，挑取绒毛组织，充分剪碎至糊状，用25 mg/L胰蛋白酶液于37℃振荡消化20 min，若发现上清黏稠，可再加DNase（150 U/L）于37℃继续振荡消化10 min，200目筛网过滤.将未消化完全的组织同法消化过滤后与第1次的滤液汇集，1000 r/min离心10 min，DMEM液洗3遍，加不含血清培养液，调整细胞数为8×108 个/L，将细胞接种于培养瓶内，37℃、50 mL/L CO2孵箱培养1 h，镜下观察，见细胞部分贴壁，稍加振荡也不浮起时，收集附壁未牢的人绒毛膜滋养层细胞，1000 r/min离心10 min，加含150 mL/L超级小牛血清的培养液，换瓶培养.当原代培养的细胞长满瓶壁的90%左右时进行传代,在倒置显微镜下直接观察细胞形态和生长状态并照相.

　　122人绒毛膜滋养层细胞的鉴定免疫细胞化学染色，取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种于预先放置有盖玻片的6孔培养板中，待细胞接近长成单层，取出盖玻片，PBS漂洗，纯丙酮固定15 min，加过氧化酶阻断液,37℃,45 min, PBS洗涤5 min×3次，加非免疫性动物血清, 37℃, 45 min,加入1∶75稀释的一抗,37℃,1 h,4℃,24 h,PBS洗涤5 min×3次，加生物素化二抗，37℃孵育1 h，PBS洗涤5 min×3次，加链亲和素过氧化酶溶液, 37℃,45 min, PBS洗涤5 min×3次,加DAB显色,镜下观察,5 min左右终止显色,梯度乙醇脱水，二甲苯透明,中性树胶封片，显微镜下观察并照相.

　　123透射电镜观察选用生长良好细胞，常规将细胞消化，移入Eppendorf管中，1000 r/min离心10  min.加40 g/L戊二醛固定4℃过夜.10 g/L四氧化锇后固定2 h，50～100 mL/L梯度乙醇脱水，树脂浸透及包埋，60℃聚合48 h.饱和醋酸铀染色10 min，枸橼酸铅染色10 min，透射电镜观察.

　　2结果

　　21细胞形态学倒置显微镜下可见均匀分布的人绒毛膜滋养层细胞呈不规则多角形， 核大卵圆形，位于胞质近中央，胞浆丰富透明.细胞为上皮样细胞形态，呈片状铺展生长.台盼兰排斥试验检测，细胞活力良好，存活率超过90%.

　　22免疫细胞化学染色角蛋白染色阳性率超过95%(Fig 1)，波型蛋白染色阳性率低于2%（Fig 2）,表明培养的人绒毛膜滋养层细胞纯度超过95%，可以满足后续试验的需要.

　　23透射电镜观察透射电镜下可见细胞外有大量微绒毛，偶见包被陷窝， 胞质中线粒体大而多，粗面内质网与糖原颗粒清晰可辩，还可见到密度高的脂滴（Fig 3）.

　　3讨论

　　胎盘绒毛组织中含有多种细胞成分，包括滋养层细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、Hofbauer细胞及血细胞等.如何排除间质细胞等其它细胞成分而保留所需成分是培养成功的关键.不同的分离方法所获得的滋养层细胞纯度从40%至90%不等.角蛋白是构成上皮细胞骨架蛋白，波型蛋白是内皮细胞及间质细胞的标志蛋白［7，8］.本研究中滋养层细胞是唯一的上皮样细胞，即角蛋白染色阳性、抗波型蛋白染色阴性，而其他贴壁细胞均是抗角蛋白染色阴性，抗波型蛋白染色阳性.

　　本研究旨在建立一种重复性好，且能获得较纯滋养层细胞的简单、实用的培养方法.本研究中血细胞及Hofbauer细胞均属非贴壁型细胞，而滋养层细胞是贴壁型细胞，故换液过程中即可弃去上述两种非贴壁细胞.滋养层细胞和成纤维细胞虽均属贴壁型细胞，但前者的贴壁速度较后者慢，另外，血清可以促进成纤维细胞增生及上皮样细胞的贴壁，我们利用这一特点，培养的起初1h采用无血清的培养基，达到抑制内皮细胞、间质细胞的快速增殖及滋养层细胞的贴壁.后续传代过程中，多次重复这一操作，可以彻底地将纤维样细胞与滋养层细胞分离.本试验利用胰蛋白酶DNase I 消化法及换瓶培养法培养的滋养层细胞纯度较高，可为后续试验提供合乎要求的试验对象.另外，该法简便易行，成本低廉，适于普通实验室推广应用.

　　【】

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