反义X区RNA和反义P区RNA小鼠体内抗HBV的比较

【关键词】  基因疗法；肝炎病毒,乙型；RNA,反义；小鼠,转基因

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of antisense RNA of hepatitis B virus (HBV) in X region and P region on replication and expression of HBV gene in HBV transgenic mice.  METHODS: Recombinant vector plasmids expressing antisense RNA complementary to HBV X region and antisense RNA complementary to HBV P region were constructed and injected into transgenic mice through tail vein. The experimental mice were divided into blank, PLXSN, PLXSNasX and PLXSNasP groups. HBV DNA in serum was tested by fluorescent quantitative  PCR and NestedPCR. RESULTS: The expression of HBV DNA in serum was inhibited in PLXSNasX group at  day  2 after injection and still inhibited at week 8, while it was inhibited in PLXSNasP group at  week 4 and reached the lowest at week 8. In PLXSNasX group and PLXSNasP group, the strongest  inhibitory effect on the expression of HBV DNA reached 58% at the 2nd week and 8th week after treatment respectively. The serum HBV DNA of 2/8 mice in the PLXSNasX group and 1/8 mice in the PLXSNasP group became negative.CONCLUSION:  The antiviral effect of antisense RNA in X region of HBV was earlier than that of antisense RNA in P  region of HBV. But the difference of antiviral effect between the 2 regions was not significant.
 
　　【Keywords】  gene therapy; hepatitis B virus;  RNA, antisense; mice, transgenic

　　【摘要】　目的： 探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)X区反义ＲＮＡ和P区反义ＲＮＡ对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响. 方法： 构建表达HBV X区反义RNA和P区反义RNA的重组载体质粒,与脂质体混合，经尾静脉注入小鼠体内，用荧光聚合酶链反应定量法检测血清HBV DNA含量，用NestedPCR法检测血清HBV DNA转阴率. 结果： PLXSNasX小鼠血清HBV DNA的复制于给药后2 d被抑制，至给药后8周抑制依然存在；PLXSNasP小鼠血清HBV DNA的复制于给药后4 wk被抑制，至给药后8周抑制处于上升趋势. 与给药前相比，小鼠血清HBV DNA的复制，在PLXSNasX组和PLXSNasP组分别于2和8 wk达到抑制高峰，抑制率均为58%； 8周后小鼠血清HBV DNA转阴率PLXSNasX组和PLXSNasP组分别为25.0%(2/8), 12.5%(1/8). 结论： HBV Ｘ区反义RNA与HBV P区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠抗HBV作用效率无显著差异，但Ｘ区反义RNA的起效时间明显早于P区反义RNA.
 
　　【关键词】 基因疗法；肝炎病毒，乙型；RNA，反义；小鼠，转基因

　　0引言

　　近年来基因是治疗乙型肝炎的研究热点之一. 而对于反义基因的体外研究已相对成熟［12］，马春红等［3］将抗HBV的反义寡核苷酸片段进行体外比较、筛选. 在此基础上，随着乙型肝炎病毒全基因模型的建立［4］对反义基因的研究逐渐转入体内. 我们在体外实验的基础上［5］将反义X区RNA和反义P区RNA转染乙型肝炎病毒转基因小鼠，研究其对HBV抑制作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料① 逆转录病毒载体(pLXSN)由鼠肉瘤病毒改建，由北京大学第一提供. 分子克隆所用的各种工具酶均购自美国Biolab公司. 质粒提取试剂盒，胶回收纯化试剂盒等购自洛阳华美公司. 引物序列由北京赛百胜公司合成. 脂质体购自美国Q.BIOgene公司.② 转基因鼠 购自广州空军医院［4］，血清HBsAg(+)， HBV DNA(+),6周龄,32只（质量18～20克），雌雄各半. ③ HBV DNA（FQPCR）检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司. HBVDNA（NestedPCR）检测试剂盒购自大连宝生生物工程有限公司.
 
　　1.2方法

　　1.2.1逆转录病毒载体的构建据HBV(ayw)基因序列［6］,合成互补于HBV(ayw亚型)X区核苷酸1400nt1430nt的X片段以及互补于HBV P 区核苷酸2375nt 2405nt的P片段,利用分子克隆技术将目的片段酶切后反向插入载体质粒的相应酶切位点，构建表达反义RNA的重组载体质粒PLXSNasX, PLXSNasP. 经酶切电泳、PCR扩增和DNA测序鉴定成功构建了HBV反义核酸重组载体.
 
　　1.2.2脂质体包裹逆转录病毒载体（质粒）的制备脂质体（20 mmol/L）与50 ml/L的葡萄糖按2：3的比例混匀,将等体积的质粒（1 mg/μL)迅速加入上述溶液，充分混匀，即得脂质体质粒混合物，室温下反应1h后应用(严格按试剂盒操作说明书进行).

　　1．2．3对乙型肝炎转基因鼠的处理将32只转基因鼠随机分为4组，每组8只. 第1组为Blank(空白对照), 第2组为PLXSN（质粒对照）, 第3组为PLXSNasX（载体反义x区RNA）, 第4组为PLXSNasP（载体反义p区RNA）. 分别在第1,  3, 5 d经尾静脉给每只小鼠注射相应的脂质体－质粒混合物200 μL，空白对照注射5 ml/L的葡萄糖溶液200 μL（试剂盒提供）. 于给药前，首次给药后3, 7 d和2, 4, 8 wk眶静脉采血(在第3 d采血时由于采血过多PLXSN组死亡两只小鼠)，10000 r/min离心10 min分离血清，置-20℃冰箱备检.
 
　　1．2．4血清HBV DNA定量检测血清HBV DNA按照乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒使用说明进行检测，结果以拷贝数/mL表示，并抑制率，抑制率=（给药前拷贝数给药后拷贝数）/给药前拷贝数×100%.

　　1．2．5血清HBV DNA定性检测按试剂盒操作说明，用NestedPCR方法检测注药前及注药后8 wk血清HBV DNA 20 g/L琼脂糖电泳PCR产物，以条带在230 bp为阳性判断.
 
　　统计学处理： 用SPSS10.0 统计软件处理. 组间比较用重复测量方差分析.

　　2结果

　　2．1反义RNA对乙型肝炎病毒转基因小鼠血清HBV DNA拷贝数PLXSNasX组小鼠血清HBV DNA含量在给药后第2 wk出现明显下降（与给药前相比P<0.05）；PLXSNasP组小鼠血清HBV DNA含量在给药后8 wk出现明显下降（与给药前相比P<0.05）；对照组小鼠血清HBV DNA含量在给药前后无明显变化（P>0.05,表1）.    PLXSNasX组小鼠血清HBV DNA含量与空白对照和质粒对照相比有显著性差异（P<0.05）；PLXSNasP组小鼠血清HBV DNA含量与其它组相比无差异（P>0.05）.

　　表1尾静脉注射反义RNA对转基因鼠HBV DNA复制的影响（略）

　　aP<0.05 vs注射前.

　　2．2反义RNA对乙型肝炎病毒转基因小鼠血清HBV DNA抑制率与对照组相比PLXSNasX组小鼠血清HBV DNA的表达于给药后第2 d出现抑制，给药后第2 wk达到抑制高峰（58%）,之后抑制作用有所下降，但直至给药后8 wk仍存在抑制；PLXSNasX组小鼠血清HBV DNA的表达于给药后4 wk出现抑制，至给药后8 wk抑制作用增强（58%，表2）.

　　2．3反义RNA作用后乙型肝炎病毒转基因小鼠血清HBV DNA转阴率给药前及给药后8 wk检测血清HBV DNA，PLXSNasX组有2只（2/8）小鼠血清HBV DNA转阴，转阴率25.0%. PLXSNasP组有1只（1/8）小鼠血清HBV DNA转阴，转阴率12.5%. 空白对照组及质粒对照组所有小鼠血清HBV DNA全部为阳性.

　　表2尾静脉注射反义RNA对转基因鼠HBV DNA的抑制率（略）

　　3讨论

　　一般药物作用于蛋白质水平，而反义技术通过与特定的mRNA特异性结合，从而阻断其表达，达到抗病毒的效果. 反义技术的作用途径主要有4点：  ①  结合后的mRNA不能正确的剪切，正确长度的mRNA不能形成. ② 结合后的mRNA不能到达正确部位，翻译功能不能进行. ③ 结合后的mRNA激活内源性的RNase，使其很快将被消化分解掉. ④ 反义RNA结合在mRNA分子核糖体结合位点上，使rRNA不能与mRNA结合，蛋白质翻译就不能启动.
 
　　在我们的研究中，PLXSNasX和 PLXSNasP小鼠8wk后 HBV DNA均有转阴，而对照组全部阳性，说明反义X区RNA及反义P区RNA对小鼠HBV有明显的抑制作用. 其抑制高峰均为58%，两者的抑制效率无明显差别.
 
　　反义X区RNA对HBV转基因鼠的抑制出现在给药后3 d，高峰在2 wk；反义P区RNA对HBV转基因鼠的抑制出现在给药后4 wk，至给药后8 wk表现明显下降趋势；反义X区RNA的起效时间明显早于反义P区RNA，在反义X区RNA对HBV转基因鼠的抑制作用逐渐下降时反义P区RNA对HBV转基因鼠的抑制作用才逐渐表现出来；这在反义RNA抑制HBV的细胞实验中未观察到，细胞实验中，相同条件下针对HBV不同区段的反义RNA对HBV抑制的起效时间相同［3，5］. 这与机体的复杂性有关，HBV DNA 的不同区段有着不同的构形，比较暴露的区段反义基因容易结合，使反义基因很快发挥作用；否则反义基因就要等待目的基因暴露，或用更多的时间来接近目的基因. 这样的现象提示我们反义RNA的抑制位点多在复制和转录，也提示我们联用起效时间不同的反义基因来延长抑制时间.

　　组间比较显示PLXSNasX组与对照组有显著差别，而PLXSNasP组与对照组差别无统计学意义. 但不能因此认为反义P区RNA无抑制疗效，因为反义P区RNA起效时间晚，在实验结束时仍表现明显的抑制作用，HBV DNA含量是否可以继续下降，HBV DNA含量的低水平能持续多久，本实验未能显示. 延长实验时间可以使义P区RNA对HBV的抑制效应进一步发挥，也可以进一步探讨反义RNA的体内作用时间，我们将继续研究.

　　【】

　　［1］ 杨林，姚集鲁，邓练，等．反义基因及反义寡核甘酸抑制乙肝病毒复制和表达的研究［J］．中华传染病杂志，2000，18：13-16．

　　［2］  张建军，陈枫，钟森，等．乙型肝病毒C区反义RNA靶向肝细胞抗病毒的研究［J］．中华肝脏病杂志，2000，6：169-170．

　　［3］  马春红，孙汶生，刘素侠，等．抗HBV最佳反义寡核苷酸片段的体外筛选［J］．中华微生物学和免疫学杂志，2000，20：12-14．

　　［4］  熊一力．高表达乙型肝炎病毒转基因小鼠的制备［J］．传染病信息，2000，13：164-156．

　　［5］  吴赤红，曾争，王勤环，等．双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究［J］．中华医学杂志，2001，81：605-608．
　　
　　［6］ Mclachlan A. Molecular biology of the hepatitis B virus［M］. CRC press, Boca  Raton,1991:215-217.