丙烯酰胺对雄性大鼠的生殖损伤及机制研究
作者：段志文，张玉敏，裴秀丛
【摘要】 研究丙烯酰胺对雄性大鼠生精功能及睾丸的损害作用，探讨产生雄性生殖毒性的原因及CYP2E1的作用。方法：选择健康成熟的雄性Wistar大鼠60只，随机分为阴性对照组（生理盐水）、ACR 20mg/kg组、诱导剂无水乙醇200mg/kg组、无水乙醇200mg/kg+ ACR 20mg/kg组、抑制剂二乙基二硫代氨荃甲酸钠(DDC)20mg/kg组、DDC20mg/kg+ ACR 20mg/kg共6组，以5ml/kg容量连续灌胃染毒4周。检测睾丸、附睾、前列腺、精囊腺脏器系数和睾丸病理；血中睾酮（T）、雌二醇（E2）含量；睾丸组织GSH、GR、GSH?Px水平；精子数，精子畸形率；曲细精管第Ⅶ、Ⅷ期各细胞成分构成变化。结果：ACR、ACR+诱导剂及ACR+抑制剂组精子数下降、畸形率升高，与阴性对照组比较存在显著差异，GSH含量显著升高（P<0.05），其它指标均无显著变化（P>0.05）。结论：ACR可引起大鼠生精功能的改变，但未观察到CYP2E1在这种改变中的明显作用。
【关键词】 丙烯酰胺；雄性生殖毒性；机制
AbstractObjective：To study the effects and the mechanisms of acrylamide(ACR) on the spermatogenesis and testis in male rats and explore the effect of CYP2E1.Methods：Sixty Wistar male rats were divided equally into six groups stochasticly, including control group (NS) and five test substances treatment groups (ACR 20mg/kg, inductor alcohol 200mg/kg, ACR 20mg/kg+alcohol 200mg/kg, inhibitor sodium diethyl dithiocarbamate(DDC) 20mg/kg, ACR 20mg/kg+DDC 20mg/kg respectively).Rats were given gastric gavage in 5ml/kg one time everyday for four weeks. The organ coefficients of testis, epididymis, prostate, seminal vesicle were measured as well as the levels of GSH, GR, GSH-Px in testis homogenate. The levels of testosterone and estradiol in serum were detected by RIA. Spermatozoa and teratospermia were counted. It was analysed that the cellular components of primary spermatocyte, prespermatid and spermatoon in seminiferous tubules Ⅶ/Ⅷ stage.Results：Compared with control group, spermatozoa count decreased significantly and teratospermia and GSH levels increased significantly in ACR, ACR+alcohol and ACR+DDC groups, Other indexes did not change significantly.Conclusion：ACR changes spermatogenesis in male rats, but not via the pathway of CYP2E1.
Key wordsAcrylamide,male reproductive toxicity;mechanism
丙烯酰胺（acrylamide, ACR）作为一种原料，应用广泛。日常生活中以淀粉为主要成分的食品经高温加工处理后可含有大量ACR，因此，ACR的毒性研究引起广泛关注。动物实验已经证实，ACR具有神经毒性、发育毒性及动物致癌性[1,2],其对生殖损害作用也已确认[3]，但机制不明。有人认为，ACR在体内经CYP2E1代谢生成的环氧ACR，其毒性高于ACR本身，但也有研究认为ACR自身的不饱和双烯键，活性要大于其代谢中间产物环氧ACR[4]。本实验针对这个问题，应用ACR代谢酶CYP2E1的诱导剂乙醇和抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸钠（DDC）对雄性大鼠进行灌胃染毒，以观察ACR的雄性生殖损害作用并对其毒作用机制进行探讨。
1 材料与方法
1.1 受试物及试剂
ACR购于北京化学试剂公司，分析纯，纯度≥99.0%；DDC购于上海三爱思试剂有限公司，纯度>99.0%，；无水乙醇沈阳市试剂三厂生产。还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.2 实验动物及分组
健康性成熟Wistar雄性大鼠60只，体重100～150g，沈阳医学院实验动物中心提供。随机分为阴性对照组（生理盐水）、ACR组(20mg/kg)、诱导剂对照组（无水乙醇200mg/kg）、诱导剂染毒组（无水乙醇200mg/kg+ACR 20mg/kg）、抑制剂对照组（DDC 20mg/kg），抑制剂染毒组（DDC 20mg/kg+ACR 20mg/kg）6组。以5ml/kg的容量连续灌胃染毒4周。染毒和观察期间自由摄食和饮水，室温控制在22℃左右，相对湿度为60%～70%，通风良好。
1.3 检测指标及方法
染毒结束后乙醚麻醉，腹主动脉取血，放射免疫法检测血中睾酮（T）、雌二醇（E2）含量；摘取睾丸、附睾、前列腺、精囊腺称重，脏器系数；每组取三只大鼠左侧睾丸Bouin液固定进行光镜病观察，并计数睾丸曲细精管第Ⅶ、Ⅷ细胞构成；右侧睾丸用生理盐水制成1：9（M:V）匀浆，检测睾丸GSH、GSH?Px、GR活力水平；剪下右侧附睾尾，称重，置于Hank’S液中，挤出精子，镜下观察精子数，并制备精子涂片，计数精子畸形率。GSH、GR、GSH?Px测定按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书操作。
1.4 统计学处理
计数资料应用χ2检验，计量资料应用单因素方差分析。
2 结果
2.1 各染毒组大鼠脏器系数变化(表1)表1ACR染毒雄性大鼠脏器系数的变化(略)注：各染毒组与阴性对照组相比脏器系数没有显著性改变（P>0.05）
2.2 各染毒组大鼠精子数与精子畸形率情况
ACR组、乙醇+ACR组和DDC+ACR组与阴性对照组比较，精子数降低，ACR组和乙醇+ACR组与阴性对照组比较，精子畸形率升高，差异均有显著性（P<0.05）(表2)。表2 丙烯酰胺染毒大鼠精子数及畸形率检测结果（略）注：与阴性对照组比，1)P<0.05
2.3 各染毒组睾丸光镜病理检测结果
曲细精管排列整齐，无坏死；曲细精管基膜完整，各细胞成分齐全，排列层次清晰，形态完整，未见水肿和固缩细胞。
2.4 各染毒组大鼠曲细精管第Ⅶ、Ⅷ期各种细胞构成变化
每只动物计数5张睾丸曲细精管第Ⅶ/Ⅷ期内各细胞成分，结果各染毒组与阴性对照组比较，各细胞组分无明显变化（P>0.05）(表3)。表3 ACR染毒雄性大鼠睾丸曲细精管细胞构成分析(略)
2.5 各染毒组大鼠睾丸组织脂质过氧化情况 ＡＣＲ20mg/kg组、诱导剂染毒组和抑制剂染毒组GSH均明显高于阴性对照组（P<0.05）；抑制剂染毒组GSH亦高于DDC对照组（P<0.05）；诱导剂染毒组GSH高于其对照组，但差异没有统计学意义（P>0.05）。GSH?Px和GR没有明显变化（表4）。表4 丙烯酰胺染毒雄性大鼠睾丸组织脂质过氧化指标检测结果（略）注：与阴性对照组比较1)P<0.05，与DDC组比较2)P<0.05
2.6 各染毒组大鼠血中激素水平
ACR 20mg/kg组E2低于阴性对照组、T高于阴性对照组，诱导剂染毒组E2及T水平均低于其相应对照组，但差异均无显著性（P>0.05）。表5 ACR染毒雄性大鼠血中激素水平的变化（略）
3 讨论
本研究染毒后期，个别大鼠后肢不能站立，活动受限，大鼠死后解剖可见严重胃肠胀气，晚期可见尿潴留，偶可见睾丸灰白色，这可能与ACR的神经毒性有关。有研究显示，小鼠因为神经损伤可继发生殖损害，使交配能力下降，精子数下降，精子损伤。有研究证明，每天给予雄性大鼠15mg/(kg·bw)ACR,连续5 d，或给予小鼠12mg/kg,连续4周，均可引起动物生殖能力下降，表现为精子计数减少和精子活动能力减弱。每天给予动物ACR 36mg/kg,连续8周可导致动物精原细胞和精母细胞变性[5]。中高剂量（85mg/kg，215mg/kg）的ACR能引起雄性小鼠睾丸精原细胞和初级精母细胞畸变率升高，且有剂量依赖关系。本研究ACR20mg/kg组精子计数比阴性对照组减少和精子畸形率的增高，诱导染毒组精子数低于其对照组，畸形率高于其对照组，但无显著性。曾有报道，低于一定剂量的ACR并不能引起实验动物的毒性损害[6]。由此可以预测ACR的毒性发挥需要一定的剂量水平。本研究染毒剂量和时间范围内，与以上实验相比生殖损害较轻，可能与因染毒剂量和染毒时间有关。
ACR对精子发生具有一定的伤害作用，使精子不能正常生成和成熟。本研究ACR20mg/kg组出现初级和次级精母细胞比例高于阴性对照组，而精细胞低于阴性对照组；这一改变虽然没有统计学意义，但可为我们提供一个信息，ACR造成精子数下降的作用环节可能是第二次减数分裂，使单倍体精细胞数量下降，进而导致精子数减少。
ACR在哺乳动物体内的代谢途径主要有两条，一是经CYP2E1的环氧化作用形成环氧ACR，另一个是与GSH直接反应解毒。GSH是一种低分子清除剂，可清除自由基，并且是GSH-Px和GST的底物，为这两种酶分解过氧化物所必需。ACR进入机体可以消耗组织中的GSH，同时机体可能应激性使GSH水平增高以对ACR解毒。本研究ACR20mg/kg组GSH水平明显高于阴性对照组，可以认为ACR使组织出现应激而导致GSH升高；抑制剂DDC染毒组比抑制剂对照组GSH水平明显升高及诱导剂染毒组高于其对照组，也说明ACR对GSH的消耗和应激性升高作用。GSH?Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异的催化GSH对过氧化氢的还原反应。其活性的升高说明组织内过氧化物增加和GSH活性的升高，与以上GSH结果相一致。诱导剂乙醇染毒组GSH?Ｐｘ高于ACR20mg/kg组，说明乙醇具有一定的诱导作用。GR可以催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）成还原型谷胱甘肽（GSH），其活力的升高亦说明组织内脂质过氧化作用增强。本研究染毒组GSH水平皆高于阴性对照组，但未出现显著性差异，说明大鼠仍处于代偿期。
由睾丸间质细胞分泌的睾酮（T）对于精子发生，附睾精子成熟，附睾性器官的生长和分泌活动，雄性行为及生长过程十分重要。外源化学物可通过直接作用于睾丸组织，或作用于下丘脑-垂体-睾丸轴而使其分泌水平发生变化。本研究中T水平诱导剂染毒组低于其对照组和高剂量组，E2水平诱导剂染毒组皆高于ACR20mg/kg组，但都没有显著性。说明本染毒剂量和时间并未损伤与T、E2合成释放相关的环节。
本次研究应用CYP2E1的诱导剂乙醇的抑制剂DDC来观察CYP2E1在ACR生殖毒性中的作用，虽然没有充分证据显示其在大鼠生精过程损伤中的主要作用，但随着染毒时间的延长或剂量的增大，CYP 2E1的作用可能会显现出来，至于本研究观察到的ACR对大鼠精子数、精子畸形率的影响，其具体机制尚需从丙烯酰胺的体内代谢、精子生成过程等各方面加以探讨。
【】
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