重组腺病毒Ad?HGF抑制博来霉素致大鼠肺纤维化的作用

              作者：徐娟, 哈小琴, 唐瑜, 昌业伟 

【摘要】  目的: 观察携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad?HGF)对博莱霉素（BLM）致大鼠肺纤维化的抑制作用，为基因防治肺纤维化探索有效途径. 方法: BLM气管内滴注0.5 mL（2 mg）制作大鼠肺损伤模型60只,分为Ad?HGF组（A组）、Ad?GFP治疗组（B组）和模型对照组（C组），各20只. 造模次日A组给予1×109 pfu Ad?HGF，B组给予1×109 pfu Ad?GFP，C组给予0.5 mL生理盐水灌注治疗；于14 d处死动物,检测肺组织匀浆中羟脯氨酸含量；做石蜡切片，用1 g/L苦味酸天狼猩红染色，偏振光显微镜观察胶原及其类型，并对切片中I型胶原进行半定量评估. 结果: Ad?HGF组羟脯氨酸含量(1.91±0.16) mg/g较Ad?GFP组(3.27±0.43) mg/g和模型对照组(3.04±0.26) mg/g低(P<0. 05);肺组织切片中的I型胶原Ad?HGF组(2.12±0.61)明显较Ad?GFP组(3.17±0.56)和模型对照组(3.38±0.66)稀少(P<0.05). 结论: 重组腺病毒Ad?HGF对肺损伤后纤维化有抑制作用.

【关键词】  腺病毒; 肝细胞生长因子; 博莱霉素; 肺纤维化

　　【Abstract】 AIM:  To explore the effect of human hepatocyte growth factor (HGF) via a recombinant adenovirus mediated HGF gene (Ad?HGF) on bleomycin (BLM)?induced pulmonary fibrosis in rats. METHODS:  Sixty Wistar rats in good conditions were intratracheally instilled with BLM 0.5 mL (2 mg), and then randomly divided into 3 groups: Ad?HGF treatment group (group A), Ad?GFP treatment group (group B) and model control group (group C), 20 rats each group. On the 2nd day after intratra?cheal administration of BLM, A, B and C groups were intratracheally instilled with 1×109 pfu Ad?HGF, 1×109 pfu Ad?GFP and 0.5 mL normal saline, respectively. All rats were killed on day 14 after treatment. Collagen content of the lung tissue was assessed by hydroxyproline concentration. Distributions of collagen fiber 4 types in lung tissue of rats were observed and the degree of fibrosis was determined by semi?quantitative estimation of I type collagen fiber under polarizing microscope with stains of Sirius red. RESULTS:  The concentration of hydroxyproline in rat lung tissue from Ad?HGF treatment group ［(1.91±0.16) mg/g］ was significantly lower than that in Ad?GFP treatment group ［(3.27±0.43) mg/g］ and model control group ［(3.04±0.26) mg/g, P<0.05］. The sections stained with Sirius red showed type I collagen fiber was fewer in the Ad?HGF group (2.12±0.61), while a huge amount of type I collagen was observed in the sections from Ad?GFP treatment (3.17±0.56) and control group (3.38±0.66); there was significant difference between Ad?HGF group and Ad?GFP group or control group (P<0.05). CONCLUSION:  Ad?HGF can repress the formation of pulmonary fibrosis in rats.

　　【Keywords】 adenoviridae; HGF; bleomycin; pulmonary fibrosis

　　0引言

　　肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)发病率逐年增高. 对PF的治疗仅限于非特异性抗炎、免疫抑制剂及糖皮质激素等，疗效尚不理想. 肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）是一多功能生长因子，在生理状态下可促进肺上皮细胞的发生、管腔形成及肺支气管上皮细胞的增生，HGF也可促进急性肺损伤的肺上皮组织增生和修复［1］. HGF有可能有效防治PF［2］. 博莱霉素（bleomycin, BLM）大鼠PF模型因与人类的PF有相似的组织学特征而被广泛用于PF的研究［3］. 为此我们采用 BLM PF动物模型，观察重组腺病毒Ad?HGF对PF过程的影响，以期为PF的治疗寻找更有效的方法.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　Wistar健康雄性大鼠60只，清洁级，体质量160～220 g，由甘肃省中医学院动物中心提供. BLM由天津太河制药有限公司提供,用时以生理盐水稀释为4 g/L；携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad?HGF)和携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(Ad?GFP)由军事医学院二所三室提供；1 g/L苦味酸天狼猩红、30 g/L戊巴比妥钠、40 g/L甲醛等试剂来自兰州军区兰州总实验中心. 偏振光显微镜及照相系统(Olympus).

　　1.2方法

　　将Wistar雄性大鼠60只实验环境训养1 wk后仰卧固定手术台上，充分暴露喉头，于大鼠吸气时将气管插管针插人气管内，深度约0.5 cm，大致第3～4软管处，可以感觉到插管触及软骨环，同时在气管插管处放置棉絮，可以看见棉絮随大鼠呼吸摆动，证明气管插管成功. 气管内注人生理盐水0.5 mL稀释的BLM,并继续向气管内推注空气0.5 mL后，立即将大鼠直立，旋转，使药液在双肺内均匀分布并冲散到末端气体交换单位. 大鼠造模后2 d，随机分为3组：Ad?HGF治疗组、Ad?GFP治疗组和模型对照组. Ad?HGF和Ad?GFP治疗组分别滴入1×109 pfu的Ad?HGF和Ad?GFP 0.3 mL, 继续滴入生理盐水0.2 mL，推入少量空气，将滴入的药物冲散到末端气体交换单位；模型对照组仅滴入生理盐水0.5 mL，推入少量空气. 给药后14 d处死动物，取出肺组织.

　　1.2.1肺组织目的基因表达取Ad?GFP组和模型对照组大鼠部分肺组织作常规冰冻切片，荧光显微镜下观察目的基因的局部表达.

　　1.2.2肺组织羟脯氨酸含量测定取同一部位适量肺组织放入冰冷生理盐水中漂洗除去血液，滤纸拭干称其湿质量适度剪碎后匀浆，按Yang等［4］方法进行测定.

　　1.2.3肺组织的胶原纤维染色将所取肺组织抽真空后用150 g/L甲醛固定，1 wk后进行石蜡包埋切片厚4 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗2 min，苦味酸染色液浸染60 min，无水乙醇迅速脱水2次，用滤纸吸去切片水，二甲苯透明和中性树胶封固. 偏振光显微镜观察胶原及其类型. 每只大鼠肺组织切片选5个视野观察I型胶原（红色纤维）的含量,依据以下标准评估：-，无;±，极少量；+，少量，线状分布；?，大量，束状或小丛状分布；?，大片状分布.

　　统计学处理： 实验数据用SPSS 11.5统计软件进行统计学处理,羟脯氨酸含量用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析；胶原含量的半定量用频数分布表示，组间胶原含量的比较采用非参数检验（Kruskal?Wallis H）.

　　2结果

　　2.1肺组织大体观察模型组大鼠肺脏颜色灰暗，光泽差，表面粗糙不平，质地较硬，仔细观察可见散在的灶状斑块；治疗组双肺表面颜色略暗，粗糙程度明显低于模型组，斑块状病灶较少见.

　　2.2肺组织目的基因表达给药后14 d Ad?GFP治疗组大鼠肺组织在荧光显微镜下可见较强的绿色荧光蛋白的表达（图1）；而模型对照组大鼠肺组织未观察到绿色荧光.

　　2.3肺组织匀浆羟脯氨酸含量14 d肺组织羟脯氨酸含量，Ad?HGF治疗组（1.91±0.16）mg/g与Ad?GFP治疗组(3.27±0.43) mg/g及模型对照组(3.04±0.26) mg/g比较，差异有统计学意义(P<0.05).

　　2.4胶原染色半定量偏振光显微镜观察，排列紧密的红色纤维为I型胶原，疏网状的绿色纤维为III型胶原，浅黄色纤维为Ⅳ型胶原. 肺组织切片中I型胶原Ad?HGF组明显较Ad?GFP治疗组和模型对照组稀少, 差异有统计学意义(P<0.05,表1，图2).表1各组胶原表达程度的频数分布（略）

　　3讨论

　　肺纤维化是多种肺疾病到晚期的共同病理变化，其病因复杂，发病机制尚未完全阐明，治疗颇为棘手. 细胞增殖因子HGF能够明显促进肺泡上皮细胞的修复［2］，抑制TGFβ的表达［5］，增强胶原酶活性，能有效抑制纤维胶原的增生形成，并可降解胶原纤维，达到防治PF的目的. 我们的研究也已证明HGF有抑制瘢痕形成［6］及抗肝纤维化的作用［7］. 我们采用基因治疗将HGF基因采用细胞内质粒DNA同源重组法构建到腺病毒载体上(Ad?HGF)，Ad?HGF 局部应用使HGF基因在肺组织表达，使肺组织成为“微型的药物工厂”，持续分泌一定时间的重组蛋白HGF，达到防治肺纤维化的目的，减少给药次数，降低成本等. 另外，腺病毒嗜呼吸系统组织，局部应用能在局部表达. 我们用BLM气管内滴注制作大鼠肺损伤模型, Ad?HGF治疗后肺组织羟脯氨酸含量可明显降低，可能通过影响细胞外基质的合成起到治疗肺纤维化的作用；肺组织切片中的I型胶原明显较对照组稀少，III型胶原明显较对照组多，表明HGF有明显减少肺组织中胶原形成的作用，重组腺病毒Ad?HGF对肺损伤后纤维化有一定抑制作用.

【】
  　　［1］Makiuchi A, Yamaura K, Mizuno S, et al. Hepatocyte growth factor prevents pulmonary ischemia?reperfusion injury in mice［J］. J Heart Lung Transplant, 2007, 26(9):935-943.

　　［2］Gazdhar A, Fachinger P, van Leer C, et al. Gene transfer of hepatocyte growth factor by electroporation reduces bleomycin?induced lung fibrosis［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2007, 292(2):L529-536.

　　［3］Iraz M, Erdogan H, Kotuk M, et al. Ginkgo biloba inhibits bleomycin?induced lung fibrosis in rats［J］. Pharmacol Res, 2006, 53(3):310-316.

　　［4］Yang ZH, Zhu MX, Gong YF, et al. Study on the application of the method of determination of hydroxyproline in rat lung ［J］. Bull Acad Mil Med Sci, 1995, 19(1), 27-29.

　　［5］Long X, Xiong SD, Xiong WN, et al. Effect of intramuscular injection of hepatocyte growth factor plasmid DNA with electroporation on bleomycin?induced lung fibrosis in rats［J］.Chin Med J, 2007, 120(16): 1432-1437.

　　［6］Ha X, Li Y, Lao M, et al. Effect of human hepatocyte growth factor on promoting wound healing and preventing scar formation by adenovirus?mediated gene transfer［J］. Chin Med J, 2003, 116(7): 1029-1033.

　　［7］哈小琴，吕同德，赵治华，等.重组腺病毒介导肝细胞生长因子基因治疗大鼠肝纤维化的实验研究［J］. 西北国防医学杂志, 2006, 27（4）：279-281.