两个STR基因座的遗传多态性研究
作者：陈庆，白洁，赵伟，刘华，崔曙，唐铁龙
【摘要】 目的: 了解成都地区汉族人群D10S2477和GATA170E02这2个短串联重复序列(STR) 基因座的等位基因片段结构特征, 获得中国成都地区汉族和泰国曼谷地区泰国人群体的遗传学数据, 并分析其在骨髓移植和法医学中的应用价值. 方法： 收集成都地区汉族和泰国曼谷地区泰国人无血缘关系个体的EDTA 抗凝血, Chelex100 法提取DNA. 采用PCR 扩增、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染及测序技术分析D10S2477和GATA170E02基因座的遗传多态性, 获得5个基因座的群体遗传学数据. 结果： D10S2477在中国成都地区汉族有9个等位基因，23种基因型，个人识别率为0.933，而泰国曼谷地区泰国人有8个等位基因，26种基因型，个人识别率为0.947；GATA170E02在中国成都地区汉族有5个等位基因，10种基因型，个人识别率为0.842，泰国曼谷地区泰国人有5个等位基因，11种基因型，个人识别率为0.873. 经统计学分析, 各基因座基因型分布均符合Hardy? Weinberg 平衡定律. 结论： D10S2477和GATA170E02 基因座的个人识别能力较高, 可用于中国汉族人群和泰国曼谷地区泰国人群的骨髓移植及法医学中个人识别和亲子鉴定, 并为人类群体遗传学研究提供可靠的数据.
【关键词】 短串联重复序列；聚合酶链反应；遗传多态性
【Abstract】 AIM: To obtain the population genetic data of short tandem repeat(STR) loci(D10S2477, GATA170E02) and study the difference of allelic frequency distributions in different populations. METHODS: Venous blood samples of 400 unrelated individuals from 2 populations (Han, Thai) were studied using single PCR followed by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining. RESULTS: Nine alleles, 23 kinds of genes were observed for D10S2477 in the Chinese Han, and the individual identification rate was 0.933, while the Thai had 8 alleles, 26 kinds of genes, and the individual identification rate was 0.947; Five alleles, 10 kinds of genes were observed for GATA170E02 in the Chinese Han, and the individual identification rate was 0.842, while the Thai had 5 alleles, 11 kinds of genes, and the individual identification rate was 0.873. The statistics analysis proved that the genotype distribution rule of the genes conformed to the Hardy? Weinberg balanced law. CONCLUSION: D10S2477 and GATA170E02 genes are easy to perform and sensitive. The discrimination power and exclusion chances of these two loci are desirable for forensic analysis and genetic study.
【Keywords】 short tandem repeat; PCR; genetic polymorphism
0 引言
人类短串联重复序列（short tandem repeats,STR）是由2～6 bp 的重复单位构成的微卫星DNA位点，是继限制性片段长度多态性（RFLPs）之后的第二代遗传学标记，广泛应用于反映骨髓移植前供、受体之间组织相容性程度及骨髓移植后供体细胞成活情况以及法医学个人识别和亲子鉴定中［1］. 运用于以上领域的STR基因座要求突变率低、稳定性好且易于标准化，D10S2477和GATA170E02基因座正是符合这些要求的STR基因座. 目前，国内少见D10S2477和GATA170E02基因座群体遗传学研究的报道. 本研究旨在调查D10S2477和GATA170E02基因座在我国汉族人群和泰国人群中的基因频率分布情况，获得上述两个人群D10S2477和GATA170E02基因座的群体遗传数据，为群体遗传学研究、骨髓移植及法医学实践的应用提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料 来自成都地区汉族和来自泰国曼谷地区泰国人的无血缘关系个体的EDTA抗凝静脉血样本各200份，采用chelex100法提取样本DNA［2］. D10S2477和GATA170E02基因座序列由NCBI数据库［3］中获得，引物设计由primer3在线设计引物软件［4］完成. 引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列如下：D10S2477：F:5′? GAA AAC CAC TTC ACC CCT CT? 3′； R: 5′? GGA AGG AAA GAA AGG AAG GA? 3′；GATA170E02：F: 5′? GAA TTG TCA CTT ACA ATG ATG TCC ? 3′； R: 5′? TCC TTA GTG TCT TTC AAT TCT GC ? 3′.
1.2 方法
1.2.1 聚合酶链反应 反应体系为37.5 μL，体系组成为：50 μmol/L引物各0.3 μL，10×buffer(1.5 mmol/L Mg2+) 3.75 μL，1 mol/L dNTP 6 μL，1.6 mg/L BSA 3.75 μL，Taq polymerase 1.5 U. 采用PE9600热循环仪，94℃变性30 s，58℃复性45 s，72℃延伸45 s，循环32次.
1.2.2 电泳 用SA? 32 垂直电泳仪，聚丙烯酰胺凝胶(T= 6%,C=5%)，600 V电泳80 min，银染显色［5-6］（图1,2）.
1：等位基因18，21；2：等位基因19；3：等位基因21，23；4：等位基因20，21；5：等位基因16，25；6：等位基因19，22；7：等位基因18，22；8：等位基因23；9：等位基因23，24；Ladder:等位基因分型标准物.
图1 D10S2477基因座电泳分型结果（略）
1：等位基因12，13；2：等位基因13，14；3：等位基因13；4：等位基因13，14；5：等位基因12，13；6：等位基因12，15；7：等位基因12，13；8：等位基因14；Ladder:等位基因型标准物.
图2 GATA170E02基因座电泳分型结果（略）
1.2.3 等位基因命名及等位基因分型标准物的构建 根据国际法医血液遗传学会推荐的命名原则［7-8］，按照核心序列重复单位个数命名. 每个基因座分别取1个PCR扩增产物纯化后测序，结果表明D10S2477片段大小为177 bp，核心序列重复次数为18，命名为D10S2477*18. GATA170E02片段大小为176 bp，核心重复序列为12,命名为GATA170E02*12. 将不同个体的DNA扩增产物与测序后已命名的样本扩增产物电泳，选取不同等位基因混合后制备成等位基因分型标准物.
统计学处理：采用Promega公司的法医学统计软件PowerStats基因频率、杂合度(H)、个人识别机率(DP)、非父排除率(PE). 采用HWE统计学软件进行Hardy? Weinberg平衡检验.
2 结果
调查的成都地区汉族和泰国曼谷地区泰国人这两个群体中，D10S2477中共发现8个等位基因，片段大小范围为177 bp～205 bp，核心序列重复次数为18～25，基因型分布及等位基因频率分布见表1，2. GATA170E02共发现5个等位基因,片段大小范围为172 bp～188 bp,核心序列重复次数为11-15,基因型分布及等位基因频率分布见表3，4. D10S2477和GATA170E02基因座在两个人群中的杂合度、个人识别机率、非父排除率等见表5.
表1 D10S2477在中国成都汉族人群中基因型分布及等位基因频率分布（略）
样本数n=200 HWE检验：χ2=1.131.
表2 D10S2477在泰国曼谷地区泰国人群中基因型分布及等位基因频率分布（略）
样本数n=200 HWE检验：χ2=1.131.
表3 GATA170E02在中国成都汉族人群中基因型分布及等位基因频率分布（略）
样本数n＝200 HWE检验：χ2=0.0471.
表4 GATA170E02在泰国曼谷地区泰国人群中基因型分布及等位基因频率分布（略）
样本数n＝200 HWE检验：χ2=1.883.
表5 D10S2477和GATA170E02基因座杂合度、个人识别机率、非父排除率（略）
HWE：Hardy?Weinberg平衡检验；H：观察杂合度；PM：匹配概率；PIC：多态性信息含量；DP：个人识别率；PE：非父排除率.
3 讨论
目前发现D10S2477等位基因有10个，核心序列重复次数为16～25，但是在本次调查的中国成都地区汉族并未发现等位基因16，而泰国曼谷地区泰国人未发现等位基因16和17. 等位基因25在两个群体中均少见，属稀有等位基因. 在中国成都地区汉族人群中频率较高的3个等位基因是等位基因18，22，19；在曼谷泰国人群中频率较高的3个等位基因为19，20，21. 两个群体的基因型分布均符合Hardy? Weinberg平衡定律，观察杂合度（H）为0.78～0.86，个人识别率为0.933～0.947，非父排除率为0.618～0.715.
有报道发现GATA170E02基因座有5个等位基因，核心序列重复次数为11～15，在本次研究中，在中国地区汉族人群和曼谷泰国人群中均发现了这5个等位基因. 等位基因15在这两个人群中均少见，出现的较高的两个等位基因在两个人群中均为12，14. 两个群体的基因型分布符合Hardy? Weinberg平衡定律，观察杂合度（H）为0.68，个人识别率为0.842～0.873，非父排除率为0.398.
我们的研究表明，D10S2477和GATA170E02基因座均为4核苷酸重复STR基因座，突变率低、易于分型、操作简单、重复性好且易于标准化. 同时，这两个基因座等位基因分布好，杂合度、个人识别率等都较高，能提供的信息量较大，在骨髓移植前后、法医学个人识别和亲子鉴定方面有较高的运用价值.
【文献】
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［5］ Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 金冬雁译. 分子克隆实验指南［M］. 2 版. 北京: 出版社, 1998: 465-467.
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