抗人β?淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定
【摘要】 目的： 运用噬菌体展示技术构建抗人β?淀粉样肽（Aβ）特异性单链抗体的抗体库并进行初步鉴定. 方法： 从Aβ免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA，分离纯化mRNA，经逆转录合成其总cDNA. 以PCR方法分别扩增出抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因片段，再经重组PCR将两基因片段由编码十五肽(Gly4Ser)3的接头连在一起，克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中，转化至大肠杆菌TG1，经辅助噬菌体M13KO7超感染后回收全部重组噬菌体，构建噬菌体抗体库，SDS?PAGE 鉴定纯度. 结果： 经琼脂糖凝胶电泳分析，RT?PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350 bp和325 bp，与预期VH，VL基因片段理论值相符. 经重组PCR得到大小约750 bp的ScFv基因片段. ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体，回收后构建成库容量为1.1×108的噬菌体抗体库，经SDS?PAGE 鉴定，得到Mr约为30000 ku，纯度较好的ScFv抗体. 结论： 成功构建了库容量大的特异性噬菌体抗体库，为抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定、临床实验诊断方法建立和应用打下基础.
【关键词】 噬菌体展示技术；单链抗体；阿尔茨海默病；β?淀粉样肽
【Abstract】 AIM: To construct and identify the specific anti?human β?amyloid peptide ScFv by phage antibody library display system. METHODS: Total RNA was extracted from spleen B cells of BALB/c mice immunized with β?amyloid peptide, and mRNA was purified from the total RNA, then the first?strand cDNA was synthesized by reverse transcription. Antibody VH and VL gene fragments were amplified by primary PCR and the amplified VH and VL PCR fragments were further joined into a ScFv gene with a 15?peptide linker DNA (Gly4Ser)3 with fill?in reactions. Then the assembled ScFv gene fragments were amplified and restriction sites were added by the second PCR. The digested ScFv gene fragments were finally ligated with the phagemids pCANTAB 5E and the phagemids containing ScFv gene were transformed into competent E. coli TG1 cells. The transformed cells were then infected with M13KO7 helper phage to rescue all recombinant phagemids with ScFv gene insert, thus an immune phage ScFv library was constructed. Purity of ScFv was analyzed by SDS?PAGE. RESULTS： Antibody VH and VL gene fragments amplified by primary PCR were about 350 bp and 325 bp after analysis by agarose gel electrophoresis and matched the expectancy of VH and VL gene fragments. The purified VH and VL PCR fragments were further joined into a ScFv gene with fill?in reactions and reached the desired 750 bp expectancy. The recombinant phagemid with ScFv gene insert was rescued, and an immune phage ScFv library with the content of 1.1×108 was successfully constructed. After analysis by SDS?PAGE, a purified ScFv gene was got with a relative molecular weight of about 30000 u. CONCLUSION: An immune phage ScFv library is successfully constructed. The successful preparation of anti?Aβ ScFv will serve as a useful tool for studying the etiological and pathological mechanism, diagnosis and treatment of patients with Alzheimer?s disease.
【Keywords】 phage display system; single chain variable fragment; Alzheimer?s disease; β?amyloid peptide
0 引言
阿尔茨海默病（alzheimer?s disease, AD），又称早老性痴呆症，是一种以记忆丧失、行为失常、人格改变、思维能力下降和认知功能障碍等为特征的中枢神经系统退行性疾病. 有研究报道β?淀粉样肽（β?amyloid peptide, Aβ）与AD的发病直接相关［1-2］. 目前国内仅有制备Aβ42多克隆抗体的相关工作，有关建立良好的血液标志物检测方法的研究报道还较少见. 本实验通过噬菌体抗体库技术［3-4］构建抗Aβ的单链抗体库，为检测血液或脑脊液中Aβ水平并用于诊断AD［5-6］和抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定以及临床治疗应用打下基础.
1 材料和方法
1.1 材料 雌性BALB/c纯系小鼠20只，6～7 wk龄(中山大学实验动物中心)；cDNA第一链合成回收试剂盒(美国Fermentas公司)；鼠ScFv 噬菌体抗体展示系统(瑞典Amersham pharmacia公司)；Trizol试剂(美国Gibco公司)；DNA多聚酶，QIAquick PCR 纯化试剂盒(荷兰Qiagen公司)；Sfi I内切酶，Not I内切酶(美国NEB公司)；T4 DNA Ligase (美国Invitrogen公司)；Aβ (美国American peptide公司).
1.2 方法
1.2.1 动物免疫 将0.5 mL的Aβ42(150 mg/L)与等量的完全福氏佐剂混合乳化，直到油包水的状态，取5只小鼠用Aβ42进行免疫. 第一次基础免疫：每只小鼠自后足垫注射0.1 mL. 基础免疫后2 wk再按上述方法用等量的抗原与不完全福氏佐剂乳化后进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射0.1 mL，共加强免疫2次. 45 d后引颈法处死免疫小鼠，取其脾脏.
1.2.2 总RNA抽提与mRNA的纯化 用TRIzol试剂抽提小鼠脾细胞的总RNA，并立即纯化mRNA，紫外分光光度计测定其浓度及纯度.
1.2.3 cDNA第一链的合成 取两个灭菌的0.5 mL的离心管，在每一管中依次加入mRNA 2 μL，Oligo(dT)18引物1 μL，去RNase水9 μL，混匀，置于70℃水浴5 min，立即置于冰中，在冰上再加入5倍稀释缓冲液4 μL，核糖核酸酶抑制剂1 μL，dNTP(10 mmol/L) mix 2 μL，混匀，室温静置5 min后再加入M?MuLV 逆转录酶(2×108 U/L) 1 μL，总反应体积为20 μL. 42℃水浴60 min，70℃水浴10 min灭活，立即置于冰中5 min，完成cDNA第一链的合成.
1.2.4 PCR扩增抗体的重链和轻链可变区片段 取两个灭菌的0.5 mL的离心管，在轻链PCR扩增管中分别依次加入cDNA模板 20 μL，轻链引物2 μL，dNTP(10 mmol/L) 5 μL，10倍稀释缓冲液 10 μL，DNA 聚合酶1 μL，ddH2O 62 μL. 重链PCR管：cDNA模板20 μL，重链引物1∶2 μL，重链引物2∶2 μL，dNTP(10 mmol/L) 5 μL，10倍稀释缓冲液10 μL，DNA聚合酶1 μL，ddH2O 60 μL. 95℃热启动5 min后，进行如下循环：94℃ 30 s，53℃ 45 s，72℃ 60 s，共30个循环，最后一个循环结束后，72℃延伸10 min，然后取5 μL PCR产物琼脂糖凝胶电泳，同时加DNA分子量标准，用紫外分析仪检测电泳结果，鉴定PCR产物片段大小.
1.2.5 重链和轻链可变区片段与Linker的连接 扩增出的抗体重链(VH)和轻链(VL)的PCR产物按Qiagen公司的QIAquick PCR 纯化试剂盒中的说明书进行回收纯化. 用琼脂糖凝胶电泳，纯化后的VH和VL与标准浓度的VH marker分别按1∶1和1∶2稀释后上样电泳进行比较定量，根据条带的亮度来估计基因片段的含量. 以相同和接近等摩尔浓度的抗体VH和VL基因混合进行重组PCR反应，按Pharmacia公司的重组噬菌体抗体库系统（RPAS）操作手册进行与Linker的连接PCR反应. 然后在PCR产物加上酶切位点后，取5 μL PCR产物用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，同时加DNA分子量标准，用紫外分析仪检测电泳结果，鉴定PCR反应产物片段的大小.
1.2.6 连接片段的克隆 取一灭菌的0.5 mL的离心管，在每一管中依次加入纯化的PCR产物17 μL，Sfi I 1 μL，10倍稀释缓冲液2 μL，50℃温育2 h，酶切产物胶回收纯化. 另取一灭菌的0.5 mL的离心管，在每一管中依次加入Sfi I酶切后的ScFv片段40 μL，Not I 1 μL，BAS 0.5 μL，10倍稀释缓冲液5 μL，ddH2O 4.5 μL，37℃温育3 h，酶切产物胶回收纯化.
1.2.7 质粒的转化与筛选 取4个灭菌0.5 mL的离心管，在每一管中依次加入纯化的酶切后ScFv 40 μL，pCANTAB 5E质粒5 μL，ATP(10 mmol/L) 5 μL，T4 DNA连接酶1 μL，5倍稀释缓冲液6 μL，ddH2O 3 μL，24℃温育1 h，每个连接产物分别进行回收纯化.
1.2.8 感受态细菌的制备 用划线法将大肠杆菌TG1接种于基本培养基平皿上，于37℃倒置培养过夜，再用无菌牙签挑取一个单菌落至5 mL的培养液中，37℃振荡（250 r/min）过夜培养. 次日取菌液1 mL接种至含有100 mL培养液的500 mL烧瓶中，37℃振荡培养至吸光度（A600 nm）达到0.4～0.5时（约需2～3 h），4℃，2500 r/min离心15 min，弃上清液，再加10 mL预冷的TSS重悬菌体，完成制备感受态大肠杆菌，2～3 h内进行转化.
1.2.9 质粒的转化 将4种纯化连接产物分别按以下方法进行转化，转化后收集的噬菌体抗体合并到一起组成噬菌体抗体库. 在无菌状态下分别取1 mL新鲜感受态大肠杆菌TG1至两个预冷的50 mL离心管中，置于冰中. 其中一个加入50 μL纯化的连接产物，另一个加入500 pg未经酶切的pUC18质粒，轻轻旋转以混合内容物. 冰浴45 min. 将试管置于42℃水浴2 min使细胞热休克，然后立即置于冰中，转化后，用质粒pUC18来检查其转化效率. 取100 μL转化后至含有900 μL的LBG（含20 mol/L葡萄糖的LB培养液）的试管中，37℃振荡（250 r/min）培养1 h，分别取100，10，1 μL的培养物在SOBAG琼脂板（含100 mg/L氨苄青霉素和2 g/L葡萄糖的SOB培养基）上铺盘，同样方法另取100 μL未进行转化的感受态大肠杆菌TG1在SOBAG平板上铺盘作为对照组. 37℃倒置培养过夜，次日菌落数.
1.2.10 噬菌体抗体库的扩增 取900 μL转化的大肠杆菌至一无菌的50 mL试管中，加入9.1 mL含10 g/L葡萄糖培养液，37℃振荡（250 r/min）培养1 h后，再加50 μL的20 g/L氨苄青霉素和4×1010 pfu的M13KO7辅助噬菌体，37℃振荡（250 r/min）培养1 h，1000 g离心10 min，弃去上清，用10 mL的不含葡萄糖的培养液重悬，37℃振荡（250 r/min）培养过夜. 1000 g离心20 min，将含有重组噬菌体的上清液转入一无菌的50 mL离心管中，0.45 μm过滤后分装保存于2℃～8℃备用，此浓缩后的噬菌体抗体库可用于富集筛选、纯化和鉴定.
1.2.11 ScFv基因噬菌体抗体库表达抗体的初步鉴定 纯化后的单链抗体用SDS?PAGE电泳鉴定其纯度，同时设分子量标准电泳，考马斯亮蓝R250染色.
2 结果
2.1 总RNA的提取及mRNA的纯化 从Aβ免疫后小鼠脾细胞中抽提总RNA，经紫外分光光度计测得总RNA浓度为5.16 g/L，纯化后的mRNA的A260 nm/A280 nm为1.90，浓度为1.28 g/L.
2.2 抗体VL和VH基因的扩增 结果显示，VH基因片段约为350 bp，VL基因片段约为325 bp，与预期VH，VL基因片段理论值大小相符（图1）.
M1: VH marker； M2: DNA marker； 1: VH PCR 产物； 2: VL PCR 产物.
图1 VH和VL基因片段的琼脂糖凝胶电泳分析（略）
2.3 ScFv基因的连接 结果如图2所示，可见约750 bp PCR扩增产物，大小符合预期结果，没有明显的非特异性条带，表明加入VH，VL和Linker 引物的浓度准确，并引入了用于在噬菌粒载体pCANTAB 5E中进行克隆的限制性内切酶SfiI和NotI位点.
M1: ScFv marker； M2: DNA marker； S: ScFv PCR 产物.
图2 ScFv基因片段的琼脂糖凝胶电泳分析（略）
2.4 抗体ScFv基因的克隆及噬菌体抗体库的构建 酶切后抗体ScFv基因片段经琼脂糖凝胶与标准浓度的ScFv marker比较，ScFv的浓度约20 mg/L. 在连接反应中，插入的ScFv基因片段与噬菌粒载体pCANTAB 5E的量为3∶1效果最理想. ScFv基因片段通过连接反应成功定向克隆至pCANTAB 5E噬菌粒载体的Sfi I和Not I位点中. 噬菌体载体成功转化至大肠杆菌TG1，经过两次培养，收集所有重组噬菌体，成功构建的噬菌体抗体库，合并，噬菌体抗体库的库容量达1.1×108.
2.5 抗体ScFv基因的噬菌体抗体库表达抗体的初步鉴定 浓缩提取的ScFv，经蛋白质L?琼脂糖亲和纯化得到Mr约为30 ku，紫外分光光度计检测结果显示，纯化后单链抗体的表达量约为1.1 mg/L，还原性SDS?PAGE结果显示纯度较好的ScFv（图3）.
1: 浓缩上清培养液； M: marker； 2: 纯化ScFv.
图3 纯化ScFv的SDS?PAGE（略）
3 讨论
目前已知Aβ蛋白在人类大脑中的沉积和神经纤维缠结的产生是AD的主要组织病标志［2］，并揭示了细胞内Aβ在大脑内沉积的现象以及Aβ具有毒性的作用机制［7-8］. 由于临床对AD诊断较为困难，尤其是发病早期，采用血标本进行检测的方法还没有完全建立起来. 因此建立新的临床试验诊断方法，尤其是检测血液中的标记物，并且能够区分AD和正常衰老以及其它痴呆的试验方法已成为热点.
噬菌体抗体库技术的建立是基因工程抗体研究领域的一次重大突破，使传统的mAb的制备完全改观，为重组抗体的设计、筛选及生产等方面的不断革新及改进提供了高效、可靠的技术和方法，极大地推动了重组抗体在科研、临床诊断及等方面的应用［10-11］. 此方法简单、快速，而杂交瘤技术从脾细胞融合到获得稳定的单克隆细胞株至少需数月［12］. 噬菌体抗体库技术可以绕过运用杂交瘤细胞免疫制备抗体，在大肠杆菌中分泌表达，通过发酵大量生产，具有大规模生产、成本低等特点，克服了杂交瘤细胞通过mAb腹水或大规模细胞培养制备抗体的局限性，同时能够保存和传代稳定性，避免了杂交瘤细胞株在传代过程中明显的不稳定性，我们的研究结果显示，直接利用人外周血淋巴细胞构建“天然抗体库”，筛选出目的噬菌体抗体，使制备全人抗体，尤其是制备自身抗原和其他弱免疫原性抗原的抗体具有独到的优势［13］，并可以对抗体基因进行改造. 在体外通过基因突变、链更替等技术，进一步提高抗体的亲和力和稳定性. 用于制备mAb，并对抗体库进行筛库时，能够得到多克隆重组噬菌体抗体，将该多克隆抗体用于临床试验诊断可提高敏感度，用于治疗可提高疗效，也可以作为分子识别、抗原表位研究的理想工具.
综上所述，本实验利用基因工程方法和噬菌体表面展示技术成功构建了免疫小鼠库容量为1.1×108的噬菌体抗体库，为抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定、临床实验诊断方法建立以及治疗应用打下基础.
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