结核分枝杆菌HSP 65亚单位疫苗和基因疫苗的构建及免疫学特性
作者：席丽，师长宏，靳亚平，张海，张廷芬，赵勇，岳晨莉
【摘要】 目的： 构建HSP 65蛋白的亚单位疫苗和基因疫苗，并与BCG相比较，评价这两种疫苗在小鼠体内的免疫学特性. 方法: 从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出hsp 65基因，连接进入pMD18?T载体中，测序后，利用不同酶切位点将完整的hsp 65基因分别克隆到pProEX HTb原核表达载体和pcDNA3.1(-)真核表达载体，前者在大肠杆菌中诱导表达，经SDS?PAGE和Western Blot分析后，用Ni?NTA亲和层析柱进行纯化；后者通过阳离子聚合物瞬转P815细胞，用间接免疫荧光检测细胞内HSP 65蛋白的表达. 用上述原核表达蛋白和真核质粒（分别为亚单位疫苗和基因疫苗）免疫BALB/c小鼠，ELISA测定特异性抗体的滴度，MTT测定脾淋巴细胞特异性增殖指数. 结果： 获得的结核分枝杆菌hsp 65基因序列与GenBank公布的完全一致；Western Blot结果显示，在Mr约65000处有与鼠抗HSP 65 mAb和临床结核患者血清的特异性结合带；免疫荧光结果显示转染重组质粒的P815细胞的表达蛋白与HSP 65 mAb有特异性结合. 两种疫苗免疫小鼠体内产生特异性抗体，经蛋白刺激后可引起脾淋巴细胞特异性增殖. 结论： 所构建的两种疫苗能引起免疫动物的特异性体液和细胞免疫反应，应进一步研究其抵抗结核分支杆菌感染的保护力机制，以用于结核病的防治研究.
【关键词】 结核分枝杆菌；热休克蛋白质类；亚单位疫苗；基因疫苗
【Abstract】 AIM: To construct the subunit vaccine and DNA vaccine based on heat shock protein 65 (HSP65) of M.tuberculosis H37Rv (MTB) and to evaluate the immunological properties. METHODS:The gene of hsp 65 was amplified from DNA genome of MTB H37Rv strain by polymerase chain reaction (PCR). The PCR product was inserted into pMD18?T vector and sequenced. The HSP65 gene segment was subcloned into prokaryotic expression vector pProEX HTb and eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (-) respectively. The former was expressed in E.coli DH5α.The target protein was identified by SDS?PAGE analysis and by Western Blot with monoclonal antibody against MTB HSP 65 and sera from clinical TB patients. Recombinant 6×His fused protein was purified by Ni?NTA purification system; the eukaryotic recombinant plasmid was transfected into P815 cells by Suohua?sofast transfection reagent, and the expression was identified by indirect immunofluorescent technology. RESULTS: The sequence of PCR product was identical with that of HSP65 gene in GenBank. Relative molecular mass identified by SDS?PAGE analysis was consistent with what had been reported, which was also confirmed by Western Blot analysis that there was a specific band at 65000 with the specific monoclonal antibody against MTB HSP65 and TB patients? sera, and there was a specific band between proteins expressed by transfected P815 and two antibodies above. CONCLUSION: The two vaccines of HSP65 are successfully constructed and possess the immunological properties. It will be helpful in further studies on diagnosis and therapy of tuberculosis．
【Keywords】 mycobacterium tuberculosis(MTB); heatshock proteins; subunit vaccine;DNA vaccine
0 引言
结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（MTB)引起，经呼吸道传播的慢性传染病. 卡介苗(BCG)接种是预防TB的主要手段，但其预防效果不稳［1］. 热休克蛋白65 (HSP 65)是热休克蛋白60家族成员之一，由groEL2基因编码, 是一种高度保守的蛋白质［2］. 在结核杆菌感染过程中，HSP 65是机体对抗其入侵的重要的免疫保护性抗原之一，该蛋白具有很强的免疫原性［3］，Yang等［4］发现在MTB感染小鼠化学后接种HSP 65 DNA，能够清除残余细菌，提示HSP 65抗原不仅可作为预防性疫苗的候选组分，也可作为治疗性疫苗的候选组分. 我们运用分子生物学技术分别构建了MTB HSP 65蛋白亚单位疫苗和DNA疫苗，并在小鼠模型上对这两种疫苗免疫学特性进行研究，为TB新型疫苗的研究提供了一定的理论和物质基础.
1 材料和方法
1.1 材料 E.coli DH5a由本实验动物中心保存，MTB H37Rv株由陕西省结核病防治研究所王瑞副主任技师惠赠. 克隆载体pMD18?T质粒购自TaKaRa公司，原核表达质粒载体pProEX HTb和真核表达载体pcDNA3.1(-)质粒均购自Promega公司. LA Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，限制性内切酶EcoRⅠ，EcoRⅤ，Hind III及DNA标记物DL2000购自大连TaKaRa公司. 质粒抽提试剂盒购自BBI公司，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗鼠IgG和羊抗人IgG购自武汉博士德公司，鼠抗MTB HSP 65 mAb购自北京博菲康公司. 纯化的HSP 65蛋白由本实验室制备，含有Ni+鳌合剂的Ni?NTA纯化试剂盒购自Invitrogen公司.
1.2 方法
1.2.1 目的基因的扩增与克隆 ①目的基因的扩增：按［5］的方法获得结核分枝杆菌毒株H37Rv的DNA，以此为模板，参照GenBank发表的hsp65基因序列设计引物. 上游片段引物：P1:AATGAATTC GATATCATGGCCAAGACAAT（含EcoR I, EcoR V酶切位点）；P2: GC AAGCTT ATCGAT TCAGAA ATC(含HindIII酶切位点)，PCR循环参数为:94℃预变性3 min，94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 50 s，共30个循环，再72℃延伸5 min. ②目的基因的克隆与测序：T4连接酶将PCR产物与pMD18?T质粒连接，转化E.coli DH5α，随机挑选4个菌落，分别接种于5 mL含100 mg/L氨苄青霉素(ampicillin，amp)的Luria?Bertani(LB)培养液，37℃振荡培养过夜. 提取质粒DNA，用EcoRⅠ和Hind III对片段进行酶切鉴定. 将筛选出的阳性克隆双向测序(由北京奥科生物技术有限公司完成测序)，记作pMD?HSP 65.
1.2.2 原核表达载体的构建及目的基因的表达、纯化 ①原核表达载体的构建及表达：pMD?HSP 65用EcoRⅠ和Hind III双酶切获得hsp65片段，将其与同样酶切的表达质粒载体pProEX HTb质粒连接，记作pPro?HSP 65，再转化DH5α感受态细胞. 挑选阳性克隆接种于5 mL含Amp的LB培养液中，37℃振荡培养18 h，分别取50 μL加到5 mL含Amp的LB培养液中，37℃振荡培养2～3 h，0.5 mmol/L IPTG 5 μL诱导4 h，收菌进行120 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS?PAGE)分析. ②HSP 65表达产物Western Blot鉴定:上述表达产物进行120 g/L SDS?PAGE后，100 V恒压电转1 h，转至硝酸纤维素膜上，10 g/L牛血清白蛋白封闭过夜，TBST洗3次，与鼠抗MTB HSP 65 mAb/临床结核患者血清（陕西省结核病提供）结合1 h，TBST洗3次，加HRP标记的羊抗鼠IgG/羊抗人IgG结合1 h，TBST洗3次，TBS洗1次，以OPD显色液显色并观察结果. ③亲和色谱法纯化目的蛋白：采用Invitrogen的Ni?NTA纯化试剂盒纯化目的蛋白，按照变性条件(denaturing condition)方法进行亲和色谱纯化，收集洗脱液. 进行120 g/L SDS?PAGE分析，剩余洗脱液经透析、复性、定量后于-20℃冻存备用.
1.2.3 真核表达载体的构建及表达产物的鉴定 ①真核表达载体的构建：pMD?HSP 65用EcoRⅤ和Hind III双酶切获得hsp65片段，将其与同样酶切的真核表达质粒载体pcDNA3.1(-)质粒连接，记作pcDNA?HSP 65. ②转染P815(小鼠肥大细胞瘤细胞)细胞：P815细胞常规培养于100 mL/L FCS RPMI?1640完全培养液中. 收集对数生长期的P815细胞，将2×105细胞接种于24孔板，细胞数量达孔底80%～90%时进行转染. 转染前用不含抗生素的100 mL/L FCS 1640培养液0.5 mL培养细胞. 将1 g/L pcDNA?HSP 65质粒2 μL和梭华?Sofast 1.5 μL混匀后缓慢加入到细胞中，6 h后加100 mL/L FCS1640培养液0.5 mL于各转染细胞孔，次日换液. 48 h后收集细胞，同时设正常细胞对照. ③转染P815细胞表达产物的间接免疫荧光鉴定：将转染的pcDNA?HSP 65质粒的P815细胞爬片, 用HSP 65 mAb作为一抗, 间接免疫荧光法检测P815细胞中HSP 65蛋白的表达.
1.2.4 免疫 ①免疫动物：6～8 wk龄雄性BALB/c小鼠40只，随机分成4组，即HSP 65亚单位疫苗组、HSP 65基因疫苗组、BCG免疫（阳性对照）组和生理盐水注射（阴性对照）组，每组10只. 亚单位疫苗组用转膜条带（50 μg/膜）免疫，每片膜免疫一只小鼠（包埋于小鼠腹股沟处皮下）共免疫3次，每次间隔2 wk；基因疫苗组，免疫前在小鼠后大腿每侧各肌肉注射2.5 g/L布比卡因50 μL做预处理，24 h后在相同部位用DNA肌肉注射，每侧50 μL，每只共计100 μg质粒/次. 每隔2wk在相同部位注射相同剂量，共免疫3次. 阳性对照组和阴性对照组分别用BCG（0.2 mg/只）和生理盐水（0.1 mL/只）进行皮下注射. 每隔2 wk收集各组小鼠血清，测定相应抗体. 免疫结束后2 wk脱颈处死小鼠，分离脾淋巴细胞，测定其淋巴细胞增殖指数. ②免疫小鼠血清中抗体的检测：在免疫的第2，4，6，8周，各组小鼠剪尾取血，分离血清，用本室纯化的HSP 65蛋白包被平板，羊抗鼠IgG?HRP作为二抗，ELISA检测血清中相应抗体. ③特异性淋巴细胞增殖实验：参照文献［6］利用密度梯度离心法分离免疫鼠脾淋巴细胞，用RPMI?1640完全培养液将分离的各组淋巴细胞密度调整至5×108/L，在96孔板中培养，200 μL/孔. 实验孔每孔加入50 μL HSP 65蛋白（15 mg/L溶于PBS）刺激，所有对照孔均不加蛋白刺激，调零孔不加脾淋巴细胞，各孔均做两个复孔. 37℃，50 mL/L CO2孵箱培养72 h后，加5 g/L MTT，20 μL/孔，继续培养4 h后终止培养，弃上清，加DMSO 150 μL/孔，振荡10 min，测定A490 nm值. 结果用刺激指数SI=A实验组/A对照组表示.
统计学处理：实验数据以x±s表示(n=10), 统计分析采用单因素方差分析, 两两比较采用LSD?t检验, P<0.05为有统计学意义.
2 结果
2.1 重组质粒pMD?HSP 65的鉴定 重组质粒双酶切后经琼脂糖电泳检测到大小为1620 bp的片段（图1）.
M:核酸maker DL2000；1:重组质粒pMD?HSP 65被EcoRⅠ和HindⅢ双酶切.
图1 重组质粒pMD?HSP 65双酶切鉴定（略）
2.2 原核表达重组质粒和真核表达重组质粒的鉴定 分别经EcoRⅠ，Hind III和EcoRⅤ，HindⅢ双酶切后琼脂糖电泳，得到大小为1620 bp的片段（图2）.
2.3 原核表达产物及纯化蛋白SDS?PAGE鉴定 取重组菌诱导前后的表达产物进行SDS?PAGE，诱导的重组菌和纯化蛋白约在65000处均有一蛋白带，同预计的大小相吻合，而空载体菌和未诱导菌无此条带，亲和色谱法纯化得到的目的蛋白经SDS?PAGE可见同样大小的蛋白带（图3）.
2.4 原核表达产物的Western Blot鉴定 在Mr约为65000处有一条表达带，表明HSP 65表达产物包含了与鼠抗MTB HSP 65 mAb及结核患者血清结合的表位（图4）.
M:核酸maker DL2000；1: pPro?HSP 65被EcoRⅠ和HindⅢ双酶切; 2: pcDNA?HSP 65被EcoRⅤ和HindⅢ双酶切.
图2 原核表达重组质粒和真核表达重组质粒酶切鉴定（略）
M:蛋白marker；1, 5: DH5α中未诱导的重组质粒pPro?HSP 65的表达产物；2～4:DH5α中诱导的重组质粒pPro?HSP 65的表达产物；6:DH5α中诱导的空质粒pProEX HTb的表达产物；7:重组质粒pPro?HSP 65表达产物的纯化蛋白.
图3 表达产物及纯化蛋白的SDS?PAGE分析（略）
1: 表达产物与鼠抗MTB HSP 65 mAb的结合带；2:空质粒阴性对照；3:正常人血清阴性对照；4: 表达产物与结核患者血清的结合带.
图4 表达产物的Western Blot鉴定（略）
2.5 真核表达产物间接免疫荧光鉴定 转染细胞在经过间接免疫荧光染色后, 阳性细胞着染有较强的荧光, 表达蛋白定位于细胞膜上, 而对照组细胞未见荧光着染（图5）.
2.6 免疫小鼠特异性抗体的水平 在一定免疫时间内，免疫小鼠的抗体水平随免疫时间的延长而持续增高. 蛋白免疫组抗体效价最高为1∶16 000，高于DNA免疫组（1∶8000，P<0.05）和BCG免疫组（抗体滴度1∶4000，P<0.01，图6）.
A：实验组；B：对照组.
图5 间接免疫荧光测定融合蛋白在P815细胞中的表达×400（略）
图6 免疫小鼠体内诱导的特异性抗体的水平（n=10）（略）
2.7 免疫小鼠特异性脾淋巴细胞增殖结果 亚单位疫苗组小鼠脾淋巴细胞经HSP6蛋白刺激后，特异性淋巴细胞增殖明显，其平均刺激指数为2.58±0.12，高于基因疫苗组小鼠脾淋巴细胞的增殖指数1.79±0.09（P<0.05）和BCG免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖指数1.58±0.10（P<0.05）.
3 讨论
HSP 65蛋白是目前确认的MTB蛋白中能诱发保护性免疫的一类蛋白，且具有较强的细胞免疫活性. 亚单位疫苗免疫效果与疫苗接种剂量、时间、接种方式以及佐剂的应用等有关［7］. 亚单位疫苗必须配以适宜的佐剂，多次接种才能达到理想的免疫效果. 在本研究中，采取将可溶性抗原转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上，以皮下包埋的方式进行免疫. NC膜不仅是抗原载体，使抗原逐渐被宿主识别，植入小鼠皮下还可以在局部起到佐剂的作用［8］，经本实验实际应用，证明是安全而可靠的免疫方法. MTB基因疫苗的研究是TB新型疫苗的优先领域［9］, 这是因为基因疫苗可刺激机体产生持久的体液和细胞免疫应答, 特别是可刺激产生CD8+ CTL反应, 这正是防治TB所需的保护性免疫反应.
我们成功构建了HSP 65蛋白的原核表达重组质粒和真核表达重组质粒. Western Blot结果显示原核表达的蛋白能与鼠抗MTB HSP 65 mAb和临床结核患者血清结合，表明其具有生物活性，同时提示了HSP 65在结核病诊断研究中有着良好的应用前景. 为了确定两种疫苗的免疫学活性，我们将上述两种疫苗免疫动物，并与BCG疫苗相比较后发现，HSP 65亚单位疫苗在抗体滴度产生的滴度上要优先于HSP 65基因疫苗，但在免疫第6周基因疫苗和BCG疫苗抗体滴度有上升趋势，而亚单位疫苗却有下降趋势，由此推断基因疫苗能够产生更持久的免疫效果；HSP 65亚单位疫苗脾淋巴细胞特异性增殖指数（2.58±0.12）高于HSP 65基因疫苗（1.79±0.09）及BCG（1.58±0.10），提示HSP 65亚单位疫苗可能诱导更为有效的保护性细胞免疫应答. 由于机体抗结核主要依赖于细胞免疫，因此尚需进一步研究这两种疫苗诱发细胞免疫的水平以及对结核感染的保护力, 才能对其效果作出全面评估.
【】
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