姜黄素对肿瘤坏死因子诱导单核细胞趋化蛋白?1表达的影响

【摘要】  目的: 观察姜黄素对肿瘤坏死因子?α （TNF?α）引起的血管内皮细胞分泌单核细胞趋化因子?1(MCP?1)的影响. 方法： 采用原代培养方法获得人脐静脉内皮细胞（HUVEC），随机分为对照组、TNF?α刺激组和TNF?α＋姜黄素组. 先用TNF?α刺激血管内皮细胞0.5 h，再加入不同浓度的姜黄素(6.25, 12.5, 25, 50和100 mg/L)共同孵育1 h与单纯TNF?α刺激作对照，采用MTT法、ELISA法和RT?PCR法检测姜黄素对细胞及其上清液中MCP?1蛋白表达的影响. 结果: HUVEC经TNF?α刺激0.5 h后，其MCP?1表达为159.37±4.47，与对照组94.13±6.07相比明显增强（P<0.01）； 再与不同浓度姜黄素共同孵育1 h后， MCP?1在细胞中的表达分别为：137.63±4.50, 121.72±1.96, 116.08±3.93和101.62±4.12，与单纯给予TNF?α刺激相比明显减弱（P<0.01），且随着浓度升高有递增的趋势. 结论: 姜黄素通过抑制炎症因子MCP?1的表达调节血管内皮细胞的炎症反应，从而发挥保护血管内皮细胞，防止动脉粥样硬化的作用.

【关键词】  姜黄素；单核细胞趋化因子；脐静脉；内皮细胞；肿瘤坏死因子

　　【Abstract】 AIM: To observe the influence of curcumin on tumor necorsis factor(TNF?α)?induced expression of monocyte chemotactic protein?1 (MCP?1) in human umbilical vein endothelial cells(HUVEC). METHODS: Human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) were cultured and divided into normal group, TNF?α stimulation group and TNF?α and curcumin associated stimulation group. HUVEC were stimulated with TNF?α for 0.5 h, then exposed to curcumin for 1 h (TNF?α and cur cumin associated stimulation group), which was then compared with TNF?α stimulation group in the expressions of MCP?1.The interaction between curcumin and HUVEC was estimated by MTT method, ELISA and RT?PCR. RESULTS: The expression of MCP?1 was increased in HUVEC stimulated by TNF?α for 0.5 h (159.37±4.47, P< 0. 01). Compared with TNF?α stimulation group, the expressions of  MCP?1 in curcumin and TNF?α associated stimulation group were decreased (137.63±4.50, 121.72±1.96, 116.08±3.93, 101.62±4.12, P<0.01).  CONCLUSION: Curcumin can modulate endothelial inflammatory response through inhibiting the expression of inflammatory factor MCP?1, and cur?cumin has protective actions against the injuries of endothelial cells and progression of atherosclerosis.

　　【Keywords】 curcumin;  monocyte chemotactic protein?1; umbilical veins; endothelial cell; tumor necrosis factor 

　　0  引言
   
　　研究表明，单核细胞的趋化主要由单核细胞趋化蛋白?1（MCP?1）来实现, 多种物质及细胞因子都可以诱导MCP?1的表达［1］. 肿瘤坏死因子?α通过诱导内皮细胞而产生MCP?1, 吸引单核细胞迁入动脉内膜而参与动脉粥样硬化的发生和. 中药姜黄的有效成分姜黄素具有抗炎、抗动脉粥样硬化的作用，但目前的研究主要围绕其对脂质过氧化的抑制及对细胞间黏附分子?1、血管细胞黏附分子?1和P?选择素等炎性因子的表达的抑制作用等方面 ［2-3］, 而对血管内皮细胞中MCP?1表达影响的研究尚少见报道. 本实验通过在离体状态下以肿瘤坏死因子?α为诱导因子，观察姜黄素对MCP?1的影响，旨在进一步阐明其保护内皮细胞，抗动脉粥样硬化的作用机制.

　　1   材料和方法

　　1.1  材料  新生儿脐带由第四军医大学唐都妇产科提供；倒置显微镜（日本Olympas公司）；M199培养基、胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物公司）；姜黄素，TNF?α（美国Sigma公司）；噻唑蓝（北京华美公司）；兔抗人MCP?1 mAb，ELISA试剂盒（北京中山试剂公司）；Ⅷ因子多克隆抗体（武汉博士德公司）；RT?PCR试剂盒（大连宝生物有限公司）；PCR所用引物由上海生工公司合成.

　　1.2  方法

　　1.2.1  人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的培养及鉴定  无菌条件下，取正常妊娠足月分娩的新生儿脐带约30 cm，用PBS反复冲洗脐静脉至无血水流出，止血钳夹住脐带一端，注入0.4 g/L Ⅰ型胶原酶10 mL后夹住另一端，在50 mL/L CO2孵育箱中消化30 min后收集消化液，1000 r/min离心8 min后收集细胞，加入含80 g/L胎牛血清的M199培养液，接种于25 mL培养瓶中，在37℃，50 mL/L CO2孵育箱中待细胞生长至融合状态用1.0 g/L胰蛋白酶和0.16 g/L 乙二胺四乙酸混合液消化传代，实验采用第3代细胞，采用SP免疫组织化学染色法［3］检测人第Ⅷ因子相关抗原.

　　1.2.2  噻唑蓝（MTT）法观察姜黄素对内皮细胞的作用  将对数生长期的细胞按密度为1.0×104 /L接种于96孔板中，每孔加100 μL细胞悬液，当细胞贴壁后进行药物干预并在37℃，50 mL/L CO2孵箱中继续培养. 实验分为对照组：M199培养液；TNF?α刺激组：M199培养液中加入终浓度为10 μg/L的TNF?α；TNF?α＋姜黄素刺激组：先加入浓度为10 μg/L的TNF?α孵育细胞0.5 h，再分别加入终浓度为6.25, 12.5, 25, 50和100 mg/L的姜黄素, 各组均在37℃条件下孵育1 h，每组设4个复孔. 实验终止前每孔加入MTT 10 μL继续培养4 h，终止培养. 吸弃培养液，每孔加入二甲基亚砜100 μL，振荡10 min, 置酶联免疫检测仪上测定570 nm波长处的A值，细胞增殖抑制率. 计算公式：细胞生长抑制率（％）＝（1-试验组A值/对照组A值）×100％

　　1.2.3  姜黄素对内皮细胞中MCP?1表达的影响

　　1.2.3.1  ELISA法检测  实验分组同1.2.3主要步骤:在含有兔抗人MCP?1 mAb包被的酶标板上, 分别加入MCP?1 500, 250, 125，62.5，31.25，15.62, 7.81和0 ng/L标准品和1∶4稀释的待测细胞上清液各0.1 mL, 37℃孵育1 h；洗板后每孔加入辣根过氧化物酶标记的工作液, 37℃孵育1 h；清洗后加入邻苯二胺底物液0.1 mL, 置暗处反应10 min, 每孔加入终止液0.05 mL终止显色反应. 在酶联免疫检测仪上492 nm 波长处测各孔 A 值, 每组6个样本, 每个样本均设定复孔.

　　1.2.3.2  半定量 RT?PCR检测   实验分组同1. 2. 3. 按Trizol法提取细胞总RNA. 逆转录合成cDNA，MCP?1基因引物：上游 5′CTCATAGCAGCCACCTTCAT 3′(20 bp)，下游5′TCACAGCTTCTTTGGGACAC 3′(20bp)；β?αctin引物：上游5′gggACCTgACTAACTACCTC 3′，下游5′CAgTgATCTCCTTCTgCATC3′；PCR扩增条件：94℃温育2 min，94℃变性45 s，57℃复性45 s，72℃延伸1 min，共35个循环，末次循环 72℃延伸10 min. 反应结束后15 g/L琼脂糖凝胶电泳后测灰度值. 用目的基因与β?actin 基因扩增片段的灰度值之比计算表达水平.
   
　　统计学处理：实验数据均以 x±s 表示, 采用SPSS 10.0统计软件进行方差处理，采用LSD 法进行检验, P＜0.05为差异具有统计学意义.

　　2  结果

　　2. 1  HUVEC 的鉴定  相差显微镜下观察细胞大部分贴壁，呈单层扁平梭形相互嵌合或多角形细胞集落，排列呈“铺路石”样（图1A）. 经SP染色法后镜下可见细胞胞质丰富，并呈棕黄色染色颗粒，为阳性反应，证实细胞来源于HUVEC 细胞（图1B）.

　　A：倒置显微镜下×100;B：倒置显微镜下经Ⅷ因子染色×20.

　　图1   原代培养的HUVEC细胞及鉴定（略）

　　2. 2  黄素对 TNF?α损伤后内皮细胞的影响  MTT检测显示, TNF?α刺激组中细胞的抑制率为（31.9±2.8）%, 明显高于对照组（16±1.0）%，(P<0.05）；TNF?α＋姜黄素（12.5, 25, 50和100 mg/L）各浓度组抑制率分别为（25.9±1.5）%, （21±0.6）%, （17.5±1.3）%和（9.6±0.6）%, 与TNF?α刺激组相比较内皮细胞的损伤明显减轻（P<0.01）.

　　2. 3  姜黄素对 TNF?α损伤状态下内皮细胞MCP?1表达的影响

　　2.3.1  姜黄素对MCP?1蛋白表达的影响  细胞经TNF?α刺激0.5 h后与对照组（94.13±6.07）相比，MCP?1表达明显增加（159.37±4.47，P<0.01）；HUVEC细胞先经TNF?α刺激后再加入12.5, 25, 50和100 mg/L不同浓度姜黄素继续作用1 h后，与对照组相比较，可明显抑制TNF?α介导的MCP?1表达（137.63±4.50, 121.72±1.96, 116.08±3.93, 101.62±4.12, P<0.01）且呈现出浓度依赖趋势，但与对照组相比在低浓度时仍明显增高，说明姜黄素有部分逆转TNF?α对细胞的损伤作用.

　　2.3.2  黄素对MCP?1 mRNA表达水平的影响  HUVEC细胞经不同浓度姜黄素和TNF?α分别干预后β?actin基因的表达产物几乎保持不变，但目的基因表达产物在TNF?α组中明显增多，在姜黄素组中随着浓度的升高逐渐减少（图2）. 结果显示，TNF?α刺激组（0.493±0.021）与对照组（0.197±0.009）相比较MCP?1表达水平明显升高（P<0.01）；而TNF?α+姜黄素（12.5, 25, 50和100 mg/L）各浓度组与对照组相比MCP?1表达水平虽仍有升高，但较 TNF?α刺激组明显降低（0.349±0.019, 0.342±0.007, 0.298±0.029，0.249±0.001， P<0.05）.

　　M：marker DL 2000；1：对照组；2：TNF?α刺激组；3～7：依次为姜黄素6.25, 12.5, 25, 50和100 mg/L不同浓度组.

　　图2  各组MCP?1 mRNA表达RT?PCR扩增产物电泳结果（略）

　　3  讨论
    
　　姜黄素为姜科姜黄属植物姜黄的主要有效成分，本实验以内皮细胞损伤为基础，从MCP?1的角度，在分子水平继续探讨姜黄素保护内皮细胞的机制［4］. MCP?1作为一种趋化因子, 在致炎因子TNF?α作用下可诱导其表达［5］，MCP?1表达升高后可引起单核细胞和内皮细胞表达黏附分子、促进炎症因子的释放，从而介导血管内皮细胞的损伤 ［6］，不仅能够促进单核细胞在粥样斑块处的浸润, 而且能促进血管壁平滑肌细胞的增殖, 对动脉粥样硬化的形成起到重要的作用［8］. 目前，可抑制细胞中MCP?1高表达的药物主要有胰岛素、噻唑烷二酮衍生物、二甲双胍、血管紧张素转移酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂、他汀类药物等［9］，而传统中药姜黄素与它们相比则具有毒副作用小，使用安全的优点.
   
　　本实验结果显示，常规培养的HUVEC细胞能分泌少量MCP?1，在TNF?α（10 μg/L）刺激后，MCP?1分泌显著增加（31.9±2.8）%，与报道一致［7-8］，当用不同浓度的姜黄素作用于损伤细胞后，与TNF?α刺激组相比能明显下调MCP?1 mRNA的水平 （P<0.05）；同时ELISA法也显示，当姜黄素浓度达到100 mg/L时，MCP?1蛋白表达为101.62±4.12, 与TNF?α刺激组159.37±4.47比较, 差异具有统计学意义（P<0.01），并且随着姜黄素浓度的升高这种保护作用逐渐增强. 我们的实验结果表明姜黄素可以抑制MCP?1的表达，且具有浓度依赖趋势.  因此，我们认为姜黄素抑制MCP?1的部分机制是从MCP?1转录水平上实现的，姜黄素所致的MCP?1 mRNA表达下调可减少TNF?α对HUVEC细胞造成的损伤. 核转录因子?kB（NF?kB）可能是介导MCP?1表达和产生的最重要核转录因子，MCP?1表达增加常与NF?κB的活化相关［10］. 而姜黄素是否也通过直接或间接阻断NF?kB的信号传导途径，抑制其活化，进一步减少MCP?1的表达，从而起到保护血管内皮的作用还有待更深入的研究.

【文献】
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　　［9］ 林 杨. 单核细胞趋化蛋白21与糖尿病动脉粥样硬化的关系［J］. 国际内杂志，2007，34（7）：381-385.

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