孤啡肽对DGP胃动力的影响

           作者：张新华，严祥，赵丽，陈明，刘纯，李艳芬 

【摘要】  目的： 探讨糖尿病胃轻瘫（DGP）大鼠血浆孤啡肽（OFQ）的变化与胃轻瘫的关系及意义.研究孤啡肽对DGP胃排空的作用. 方法: SPF级雄性Wistar大鼠90只随机分为正常对照组(n=15)和实验组(n=75).正常对照组以普通饲料喂养20 wk，实验组以高脂高糖饲料喂养6 wk后小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射加高糖高脂饲料及饮食失节法继续诱导20 wk，建立糖尿病模型.应用放射性核素胃排空法筛检出DGP及糖尿病(DM)大鼠模型.采用酶联免疫法测定空腹血浆OFQ，而后将DGP再随机分为3组, 分别给予OFQ 0.6, 6.0, 60.0 nmol/kg静脉注射，每日1次, 连续5 d, 再次测定胃排空. 结果： 正常对照组、DM组及DGP组胃半排空时间(GET1/2)分别为(61.9±4.6), (66.5±2.3), (168.9±10. 6) min, DGP组GET1/2 较正常对照组、DM组显著延迟, 差异有统计学意义(P<0.05). DGP组血浆OFQ较正常对照组、DM组显著降低，差异有统计学意义［(5.30±1.70)ng/L vs (9.83±5.70), (8.90±3.50)ng/L, P<0.05］.相关性分析显示, 血浆OFQ水平与胃轻瘫之间呈负相关关系 (r=-0.6726, P=0.004). DGP大鼠静脉注射OFQ 0.6, 6.0, 60.0 nmol/kg后胃半排时间较前有明显缩短［(136±7) vs (166±8) min, (101±12) vs (162±11) min, (112±10) vs (158±12)min，P<0.05］，前后差异有统计学意义(P<0.05)，其中6.0 nmol/kg的剂量已经接近或达到最大治疗效果，增加OFQ剂量并不能相应提高其治疗效果.结论： OFQ在DGP中起着重要的调节作用，与DGP胃半排时间呈负相关.静脉注射OFQ可以明显缩短DGP大鼠的GET1/2，其中6.0 nmol/kg的剂量已经接近或达到最大治疗效果.

【关键词】  孤啡肽；糖尿病并发症；胃肌轻瘫；胃排空；大鼠

　　【Abstract】AIM: To explore the expression level of orphanin (OFQ) and its correlation with diabetic gastroparesis(DGP)and then to evaluate the effect of OFQ expression level on gastric emptying in DGP rats.  METHODS: Ninety male SPF Wistar rats were first divided randomly into 2 groups: control (n=15) and experimental group (n=75). The controls were fed ordinary laboratory diet for 20 weeks, but the rats in experimental group were fed fat?and caloric?rich laboratory diet for 6 weeks, injected with small dose of streptozotocin, and then continuously fed fat?and caloric?rich laboratory diet until 20 weeks to develop diabetic models. Radionuclide gastric emptying method was used to screen DGP rats and diabetes mellitus (DM) rats. Gastric emptying (GET1/2) was measured by SPECT. Enzyme?linked immunosorbent assay was employed to examine the level of plasma OFQ. The diabetic gastroparesis rats were then subdivided into 3 groups, treated with OFQ at a dose of 0.6, 6.0 and 60.0 nmol/kg, respectively, once a day for 5 d. GET1/2 was measured again. RESULTS: GET1/2 was significantly delayed ［(168.9±10.6) min］ in DGP rats compared with that in the control group ［(61.9±4.6) min］ and DM rats ［(66.5±2.3)min, P<0.05］. Similarly, 90 min residual rate was higher in DGP group ［(89.5±2.9)%］ than that in the control group［ (46.4±3.6)%］and DM group ［(50.9±4.1)%］ (P<0.05).  Plasma level of OFQ in DGP group ［(5.30±1.70)  ng/L］ was lower than that in the control ［(9.83±5.70)ng/L］ and DM group ［(8.90±3.50) ng/L］ (P<0.05). A negative correlation was found between plasma OFQ level and GET1/2 in DGP rats (r=-0.6726, P＝0.004, <0.01). A significant decrease in GET1/2 in DGP rats was observed pre-and post?treatment with OFQ (P<0.05). A satisfactory treatment effect was achieved at a dose of 6.0 nmol/kg OFQ and further increase in OFQ dose did not result in a better effect. CONCLUSION: OFQ plays an important role in DGP. The plasma OFQ level is negatively correlated with GET1/2 in DGP rats. It elucidates that OFQ can promote the gastric emptying in the DGP rats.

　　【Keywords】 orphanin;diabetes complicaetions; gastroparesis; gastric emptying; rats

　　0  引言
   
　　糖尿病性胃轻瘫（diabetic gastroparesis，DGP)以胃肠动力不足为主要特征.目前临床治疗主要应用促进胃肠动力的药物缓解症状，疗效欠佳.孤啡肽(Orphanin FQ, OFQ)或痛敏素(nociceptin)是一种具有拮抗吗啡镇痛作用的内源性阿片肽类物质.有研究认为OFQ是一种胃肠道内的活性肽类物质和胃肠功能的内源性神经调节剂［1］. 对于OFQ的研究目前主要集中在减轻疼痛和其他生理活动中的作用，其胃肠功能调节的生物学效应尚未完全阐明.研究DGP大鼠血浆OFQ的变化、OFQ对DGP大鼠胃排空的作用、以及OFQ剂量与胃排空的关系，将有助于拓宽胃肠动力紊乱的治疗思路. 

　　1   材料和方法

　　1.1   材料  SPF级雄性Wistar大鼠90只, 体质量(225±15)g，由甘肃中医学院SPF动物实验中心提供；链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司；血糖测定仪及试纸由强生公司提供；OFQ ELISA试剂盒为美国ADL公司的产品; MK?2酶标仪JZW?I?20；OFQ由兰州大学生命学院人体与动物机能实验室提供；同位素99mTc2二亚乙三胺五醋酸(DTPA)由医学科学院同位素研究所提供；以色列Elscint Helix公司的双探头单光子发射机断层照相仪.

　　1. 2  方法

　　1.2.1  动物分组与实验处理  随机选取15只大鼠作为正常对照组，该组以普通饲料喂养.另75只为实验组大鼠, 以高脂高糖饲料（100 g/L猪油、200 g/L白糖﹑25 g/L胆固醇，10 g/L胆酸盐﹑665 g/L常规饲料）饲养，两组诱导6 wk后正常对照组经腹腔注射等量枸橼酸钠缓冲液，实验组经腹腔注射枸橼酸缓冲液配制的链脲佐菌素（STZ）(30 mg/kg).72 h后尾静脉采血测定空腹血糖，以空腹血糖高于16.7 mmol/L确定为糖尿病模型建立成功.有65只达标，8只不达标，造模过程中死亡2只.3 d后补注STZ（15 mg/kg, ip），测定血糖2只达标，6只不达标剔除实验. 67只糖尿病大鼠造模成功后，不用胰岛素和任何降糖药物控制血糖.以高脂高糖饲料以及饮食失节法继续饲养20 wk，每周检测血糖和体质量，20 wk后应用放射性核素胃排空法，以正常对照组为正常范围［2］，筛检出DGP大鼠53只，将胃排空功能正常的大鼠设为糖尿病组（n=14）. 随机选取DGP大鼠（n=16）心脏采血, 分离血浆, 置-80℃超低温冰箱保存，待测.剩余37 DGP只大鼠，其中3只于尾静脉注射过程中在固定器内窒息死亡，剩余34只再随机分为3组, 分别给予OFQ 0.6（n=10), 6.0(n=12).60.0 nmol/kg(n=12)尾静脉注射, 连续5 d，每日1次, 第5 日注射后再次进行胃排空、体质量及血糖测定.

　　1.2.2  核素胃排空功能测定  采用同位素闪烁计数法(APEXSP26, Elscint Inc 公司)检测胃排空功能.大鼠禁食12 h、禁水6 h后，应用含有同位素99 mTc2 DTPA标记的蒙牛纯牛奶大鼠腹部为目标区（窗宽20％，矩阵128×128，放大倍数3.0），行放射性活性1.5 mL (99MTc?DTPA 0.5 mCi)，通过灌胃器缓慢注入胃内.之后立即将大鼠仰卧绑缚于特制固定架上，以采集.前半小时每5 min采集1次，然后每15 min采集1 次，共采集11次，连续测定90 min. 通过随机软件，计算出各项指标的校正值及胃的排空曲线.

　　1.2.3  酶联免疫法测定血浆OFQ  大鼠空腹12h（禁食不禁水）后在吸入乙醚麻醉后对各组进行心脏采血，血液置入预冷的含抑肽酶(500 IU/L)和乙二胺四乙酸二钠(EDTA Na2，10 g/L)的塑料指型管中，充分混匀后，4℃，3000 r/min，离心10 min，留取血浆-80℃保存，统一采用ELISA方法测定孤啡肽，各步骤严格按照说明书操作.
   
　　统计学处理：各组指标用x±s表示, 组间差异用方差分析, 以P<0.05为有统计学意义.用Pearson直线相关法进行相关分析, P<0.05为有统计学意义. 应用SPSS 11.5软件进行数据处理，Sigmaplot 10.0软件作图.

　　2  结果

　　2.1  大鼠体质量  正常对照组大鼠体质量在实验期间由(223±16) g增至(420±18) g，实验组大鼠初始体质量为(221±29) g, 与正常对照组大鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05，图1）. 造模前6 wk实验组大鼠体质量增长迅速，经STZ诱导为糖尿病模型20 wk后, 实验组大鼠体质量较成模前明显下降(P<0.05). 协方差分析表明，DGP大鼠体质量［(300.0±23.2) g］较正常对照组、DM组明显下降，正常对照组大鼠体质量的增长显著高于DM组和DGP组(P<0.05). 给予OFQ治疗后3种剂量组大鼠的体质量前后比较差异无统计学意义(P>0.05).

　　2.2  大鼠血糖  正常对照组大鼠的初始血糖为(5.7±0.6) mmol/L, 20 wk后为(7.1±0.5) mmol/L，前后差异无统计学意义(P>0.05). DM, DGP大鼠在腹腔注射STZ 72 h后其空腹血糖水平 ［(23.5±5.2), (22.9±4.3) mmol/ L］ 较正常对照组大鼠显著增高，差异有统计学意义(P<0.05). DM, DGP组大鼠血糖变化在随后的20 wk无统计学意义, DGP各组给予OFQ后前后血糖变化无统计学意义(P>0.05).

　　2.3  胃半排空时间、胃内核素残留率  正常对照组大鼠胃半排空时间(GET1/2)为(61.9±4.6) min，90 min后胃内核素残留率为(46.4±3.6)%. 以正常对照组为正常范围, 筛检出DGP大鼠, DGP组大鼠GET1/2为(168.9±10.6) min, 90 min后胃内核素残留率为(85.6±2.9)%, 均显著延迟或高于正常对照组和DM组, 差异有统计学意义(P<0.05).DM组大鼠GET1/2为(69.6±3.0)min, 90 min后胃内核素残留率为(50.9±4.1)%, 与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）.

　　DGP：糖尿病胃轻瘫；DM：糖尿病.

　　图1  3组大鼠体质量的变化（略）

　　2.4   血浆OFQ含量与胃半排空时间相关性分析  正常对照组大鼠血浆OFQ与DM组比较差异无统计学意义［(9.83士5.70) vs (8.90士3.50)ng/L, P>0.05)］.DGP组大鼠血浆OFQ［(5.30士1.70)ng/L］与DM组、正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05), 血浆OFQ含量与GET1/2有负相关关系(r=-0.6726，P=0.004，图2）.

　　图2  血浆孤啡肽与胃半排空时间相关性（略）

　　2.5  DGP大鼠在OFQ治疗前后的胃半排空时间  3组DGP大鼠给药后GET1/2都较本组治疗前显著缩短, 前后比较差异有统计学意义(P<0.05，表1）.方差分析表明，6.0, 60.0 nmol/kg组大鼠的GET1/2在给药后与0.6 nmol/kg组比较差异有统计学意义(P<0.05). 6.0, 60.0 nmol/kg组大鼠的GET1/2在给药后比较差异无统计学意义(P>0.05).

　　表1  3种剂量孤啡肽治疗糖尿病胃轻瘫大鼠胃半排空时间的比较（略）

　　aP<0.05 vs 0.6 nmol/kg组； cP<0.05 vs 给药前

　　3  讨论
   
　　DGP的胃肠动力障碍，不仅影响患者食物的吸收和消化, 还因影响口服药物的吸收而给糖尿病的治疗带来极大的干扰. 目前认为可能是自主神经功能障碍、胃肠激素分泌异常、高血糖、平滑肌损害以及微血管病变等因素综合影响的结果. OFQ是一种新近发现的内阿片肽, 与经典的阿片肽一样属于脑肠肽，作为一种胃肠道内的活性肽类物质，它是一种新的胃肠功能的神经调节剂［1］. 许多学者证实OFQ与经典的阿片肽一样定位于大鼠的肠神经系统，属于肠神经系统的神经递质，参与肠神经系统对胃肠动力、内分泌、粘膜血流及免疫功能的调节［3］. 相对于胃肠道来讲，肠神经系统的作用要大于中枢神经系统. OFQ作为重要的脑肠肽之一, 高度表达于胃肠神经系统而非平滑肌上［4］. Krowicki 等［5-6］发现静脉注入0.6～60.0 nmol/kg OFQ可提高大鼠胃的收缩活性，提高胃内压. 有研究检测了健康人、肝硬化到肝癌患者的血浆OFQ水平, 证实呈梯度升高趋势，可为临床诊治肝脏肿瘤提供旁证［7］. 另外血浆OFQ在肝豆状核变性病［8］、慢性胆囊炎、慢性胃炎及十二指肠球部溃疡中皆升高，在急性胰腺炎呈现进行性升高［9］. 而在糖尿病胃动力障碍的长期慢性状态下血浆OFQ水平的变化目前尚未见研究. 本研究采用ELISA方法测定血浆OFQ水平，发现DGP组明显低于正常对照组和DM组, 提示血浆OFQ水平在DGP时明显下降. 以上的结果说明可能由于长期糖尿病造成了微血管、胃肠肌间神经和肠神经系统神经细胞变性，导致肽能神经受损 ［10］. 使得定位于大鼠肠神经系统的内源性肠神经递质之一的OFQ减少，由于DGP大鼠体内缺乏促进胃肠动力的内源性神经肽OFQ, 导致OFQ促进胃肠动力的作用减弱，从而引起DGP大鼠出现一系列胃肠动力障碍的胃肠道症状. 并且随着血浆OFQ含量呈现下降趋势，GET1/2的延迟时间呈现延长趋势，相关性分析显示血浆OFQ水平与GET1/2呈显著负相关, 提示血浆OFQ的含量越下降，胃排空延迟时间越长，说明OFQ在DGP的发病中起着重要的调节作用. 本研究静脉给予0.6，6.0，60.0 nmol/kg 3种剂量OFQ对DGP大鼠再次测定胃排空，作前后比较治疗效果有统计学意义，说明OFQ是具有促进胃肠动力作用的内源性神经肽. 其中6.0 nmol/kg的剂量已经接近或达到最大治疗效果, 说明增加OFQ剂量并不能相应增加其治疗效果，与上述研究结果一致［5-6］. 故认为OFQ含量的减少可能是DGP胃动力减弱的因素之一，进一步研究OFQ与胃肠动力障碍的发病机制将有助于拓宽胃肠动力紊乱的治疗思路.

【】
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