慢病毒载体介导半乳凝素?3?shRNA沉默基因对肿瘤细胞的影响

             作者：王明栋，王洪，马文斌，史彦芳，王任直

【摘要】  目的: 构建干扰半乳凝素?3（Galectin?3）的重组U6慢病毒质粒，体外评价和观察内源性小RNA干扰效果及对细胞增殖和凋亡的影响. 方法: 根据siRNA设计原则，设计合成短发夹DNA，用于体内转录合成干扰Galectin?3编码序列的发夹RNA. 连接，筛选，酶切，鉴定pGCL?GFP/U6 Gal?3shRNA?1；以含无关序列发夹结构的质粒载体为对照，感染乳腺癌细胞系，采用RT?PCR和Western Blot检测mRNA和蛋白表达水平与对照组的差别；MTT法和流式细胞检测其对细胞增殖、凋亡的干扰情况. 结果: 测序证实重组质粒构建成功，体外试验表明，Galectin?3的mRNA和蛋白表达均一致降低，转染组为（0.028%），阴性对照组为（0.617%），空白对照组为（0.992%），转染组mRNA干扰效率达95%（P<0.05）；Galectin?3蛋白表达明显下调，与阴性对照组和空白对照组相比较，差异有统计学意义（P<0.05）. MTT检测结果转染组为（0.40±3.69）%，阴性对照组（0.71±0.16）%；转染组和阴性对照组间差异均有统计学意义（P<0.05）. 细胞凋亡百分率为68.78%. 结论: 慢病毒介导的Galectin?3?shRNA成功在体外敲减了肿瘤细胞的目的蛋白，影响了肿瘤的发生与.

【关键词】  慢病毒载体；半乳糖凝集素?3；shRNA；基因沉默

　　0引言

　　半乳凝素?3（Galectin?3），是一种近年发现的所有脊椎动物中结构特殊、仅有的嵌合型，有两个不同的结构域，由单一LGALS3基因编码［1-2］. 在甲状腺、乳腺、垂体腺等肿瘤中表达，具有多效性生物功能，如细胞黏附、抑制凋亡、细胞周期调节，pre?mRNA等 ［3-4］. 在侵袭性垂体泌乳素腺瘤胞浆内蛋白和mRNA高表达，结合核分裂相，对判断侵袭性和预后方面有一定作用［5-6］.目前将Galectin?3基因体外敲减（konck down），研究内源性小RNA对它影响的相关报道还很少. 采用逆转录病毒载体，来提高外源siRNA(small interference RNAs, siRNAs)基因导入，但细胞存在着抵抗性. 本研究旨在通过对Galectin?3的RNAi重组含U6启动子慢病毒表达载体的构建和鉴定，体外观察和评价内源性小RNA对Galectin?3基因及肿瘤细胞凋亡、增殖等的影响，为探索侵袭性肿瘤的基因提供实验依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料人乳腺癌细胞系MCF?7由本实验室保存. DMEM培养基(Dulbcco?s Modified Eagle edium) 和新生小牛血清(美国Gibco公司)；慢病毒（上海吉凯基因生物技术有限公司)；质粒提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，限制性内切酶：T4 DNA连接酶、大肠杆菌DH5α，Taq酶，dNTP Mix(大连宝生生物有限公司)；Galectin?3试剂(美国Invitrogen公司)；山羊抗人Gal?3多克隆抗体 (美国Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶偶联兔抗羊IgG抗体(北京中山生物技术有限公司)；甘油醛?3?磷酸?脱氢酶(上海邦成生物技术有限公司)；化学发光试剂盒、四甲基偶氮唑盐（MTT），二甲亚砜（DMSO）（美国Santa Cruz公司）；总RNA抽提Trizol，SDS?硝酸纤维素膜（北京鼎国生物技术有限公司）；RNA逆转录试剂盒（美国Fermentas公司）；相差倒置荧光显微镜（日本Olympaic公司）； 定量PCR仪(RG?3000)（美国Biochem公司）；蛋白电泳及转膜系统（美国Bio?Rad公司）；测序引物由北京三博远志生物技术有限公司合成. 凝胶成像仪（美国GelDoc 1000 型Bio?Rad）摄像分析, 酶联免疫检测仪（美国产DG5031型），紫外线分光光度仪（日本UV?240，Shimadzu公司），其他试剂均为进口或国产分析纯.

　　1.2方法

　　1.2.1构建携带特异shRNA编码序列的RNAi质粒根据人Galectin?3基因序列(GenBank No.NM_002306)mRNA的第653位点设计合成caGGAGAGTCATTGTTTGCAA，G/C含量为42.10%，病毒载体构建框架序列为5′?TcaGGAGAGTCATTGTTTGCAA TTCAAGAGATTGCAAACAATGACTCTCCtgTTTTTTC?3, 5′?TCGAGAAAAAAcaGGAGAGTCATTG TTTG　CAATCTCTTGAATTGCAAACAATGACTCTCCtgA?3′,经BLAST比对该序列与人其他基因无明显同源性. 经双链DNA oligo制备，15 mL/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis PAGE）凝胶检测双链形成效率，载体的线性化双酶切，4℃ 12 h连接反应，转化，阳性克隆的PCR鉴定，Up（+）: 5′?GCCCCGGTTAATTTGCATAT?3′，Down(-): 5′?GTAATACGGTTATCCACGCG?3′，挑选阳性克隆?1菌液送测序，阳性克隆质粒抽提，制备慢病毒包装质粒DNA溶液至含单层293T细胞的培养液中，混匀，培养；收集转染72 h的293T细胞上清液，离心过夜，-70℃冰箱中保存. DMEM培养液重悬病毒颗粒稀释液，倒置荧光显微镜下检测GFP表达量,病毒滴度.

　　1.2.2细胞培养人乳腺癌细胞系，在高糖DMEM培养基于37℃，50 mL/L CO2恒温孵箱培养. 细胞生长达80%融合时传代. 转染前1 d,将对数生长期的细胞以3×105个/孔接种于6孔板.

　　1.2.3慢病毒质粒感染细胞接种3×105/孔MCF?7细胞于6孔板,待细胞会和达30%~50%时，取10 μL细胞悬液，与等体积400 mg/L的台盼兰溶液混合，数分钟后，血球计数板计数细胞. 实验分为转染组（pGCL?GFP/U6 Gal?3shRNA?1），阴性对照组（为无关序列的发夹结构质粒载体）和空白对照组（未加任何质粒）. 根据不同感染复数值（Multiplicity of infection，MOI），加入适量病毒12 h后，对三组细胞采用光镜下观察细胞形态、状态结合荧光镜下观察细胞绿色荧光，若未见明显的细胞毒性作用，则继续培养48 h后更换培养基；若有明显细胞毒性作用，则立即更换培养基，感染4~5 d后，观察慢病毒所带报告基因GFP的表达情况，感染效率大于50%者继续培养，然后收集细胞抽提RNA进行RT?PCR检测实验；感染效率低于50%的实验组，则重新感染实验.

　　1.2.4细胞生长活力检测细胞于感染后的12，24，48，72和96 h不同时间点分别计数，胰酶消化制备成单细胞悬液，以1×104/孔细胞密度接种于接种于96孔板内. 转染组，阴性对照组和空白对照组，每组各设5个复孔，每孔加入20 μL MTT溶液5 g/L后培养4 h,弃取培养基后，每孔再加入150 μL的DMSO，室温避光振荡10 min，在酶联免疫检测仪492 nm波长处测定吸光度A值. 实验结果取每组5个复孔的平均值，按以下公式计算细胞生长活力率. 细胞生长活力率（%）=转染组细胞A值/对照组细胞A值×100%.

　　1.2.5RT?PCR分析Galectin?3的基因表达分别对慢病毒质粒感染的转染组，阴性对照组和空白对照组的3组细胞用Trizol裂解提取总RNA. 每组取1 μL用紫外线分光光度仪及10 g/L的琼脂糖凝胶电泳测RNA产量、纯度和完整性，取1 μg mRNA用M?MuLV逆转录酶进行逆转录反应,合成cDNA；设20 μL RT反应体系，引物序列应用oligo软件自行设计Primer1: 5?ccactgattgtgccttat?3 Primer 2 : 5?gc aacatcattccctcttt?3，GAPDH为内参照标化Galectin?3 mRNA的表达,反应条件如下：94℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 30 s，GAPDH的退火温度58℃，共25个循环，每组取10 μL PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪摄像分析.

　　1.2.6Western Blot法分析Galectin?3蛋白表达对慢病毒质粒感染的转染组，阴性对照组和空白对照组的三组细胞加蛋白裂解液收集蛋白样品，取1 μL用紫外线分光光度仪测蛋白浓度，蛋白上样量2 μg用15 mL/L十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）?PAGE. 电转移PVDF膜，1×丽春红洗涤50 g/L脱脂奶粉封闭，1∶100一抗4℃过夜孵育，次日TBST缓冲液（0.05％Tween20的TBS缓冲液）洗膜后再加兔抗羊二抗(工作浓度为1∶1000) 室温孵育，GAPDH浓度（内参照）1∶1000，1 h孵育，TBST缓冲液洗膜4次每次10 min. 用发光加强法（enhanced chemi luminescence, ECL）化学发光显影,X光片曝光显影，凝胶成像分析系统摄像分析.

　　1.2.7对肿瘤细胞凋亡的观察细胞实验前于12 h换液，用胰酶消化，取1×106个细胞离心沉淀，用PBS缓冲液洗2次，加入700 mL/L的乙醇，4℃避光固定，1~2 h期间多次振荡；4000 r/min离心5 min，加入有RNA酶（RNase）的PBS缓冲液至少30 min,再次离心，加入碘化丙啶（propidium iodide, PI）1 mL,避光30 min，上流式细胞仪检测.

　　统计学处理：用SPSS12.0软件进行统计分析,实验数据以x±s表示,多组间均数比较用单因素方差分析检验，P＜0.05为差异具有统计学意义.

　　2结果

　　2.1慢病毒质粒鉴定包含特异的Galectin?3 shRNA编码序列，经酶切，PCR和测序鉴定质粒构建成功，此慢病毒重组载体为pGCL?GFP/U6 Gal?3 shRNA?1（图1，2）.

　　M： 分子量标记； 1： 原始载体； 2： 载体酶切（Hpa/Xho）.

　　图1pGCL?GFP/U6 Gal?3 shRNA?1酶切电泳图（略）

　　图2pGCL?GFP/U6 Gal?3shRNA?1测序结果（略）

　　2.2内源性小RNA干扰Galectin?3的效率RT?PCR分析显示，MCF?7细胞系中pGCL?GFP/U6 Gal?3shRNA?1转染组mRNA表达量为（0.028%），同阴性对照组（0.617%）和空白对照组（0.992%）相比较，pGCL?GFP/U6 Gal?3shRNA?1转染组的mRNA干扰效率达到95%（P＜0.05，图3）.

　　M： 200 bp DNA ladder； 1： 无关序列发夹结构质粒载体的阴性对照组； 2： pGCL?GFP/U6 Gal?3shRNA?1转染组； 3： 空白对照组.

　　图3RNAi后细胞内mRNA的变化（略）

　　2.3慢病毒质粒RNA干扰Galectin?3的鉴定Western Blot检测结果显示，转染组Galectin?3蛋白表达明显下调，与阴性对照组和空白对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）. 阴性对照组和空白对照组相比较，差异无统计学意义（P＞0.05，图4）.

　　1： 空白对照组； 2： 无关序列发夹结构质粒载体的阴性对照组； 3： pGCL?GFP/U6 Gal?3shRNA?1转染组.

　　图4RNAi后细胞内蛋白质表达的变化（略）

　　2.4对MCF?7细胞生长的影响MTT法检测细胞活力结果显示: pGCL?GFP/U6 Gal?3shRNA?1转染组为（0.4±3.69）%，阴性对照组（0.71±0.156）%；阴性对照组与pGCL?GFP/U6 Gal?3shRNA?1转染组相比较，组间差异具有统计学意义（P＜0.05）.

　　2.5PI单染色肿瘤细胞变化阴性对照组细胞凋亡发生率为10.32%，pGCL?GFP/U6 Gal?3shRNA?1转染组为68.78%，明显高于阴性对照组（P＜0.05，图5）.

　　3讨论

　　Galectin?3是半乳凝素基因家族中的一员，在不同肿瘤其表达水平不同，主要与凋亡、细胞黏附、细胞增殖等功能相关. 在不同分化状态的细胞和组织类型中它具有双重功能即抗凋亡及促凋亡的作用［7］. 一般认为，肿瘤发生与凋亡的抑制有密切关系，Galectin?3抗凋亡主要在磷酸化位点Ser6，Ser12磷酸化不超过10%［3］ . 目前体外研究观察肿瘤细胞的内源性小RNA，对Galectin?3功能影响及发生机理尚未完全明了.

　　A： 无关序列发夹结构质粒载体的阴性对照组； B： pGCL?GFP/U6 Gal?3shRNA?1转染组.

　　图5流式细胞仪检测结果（略）

　　本研究选用不影响连续传代、能感染非分裂期和分裂期细胞，其本身带有shRNA表达框和一个表达EGFP报告基因的慢病毒载体(lentiviral vect or, LV)，便于细胞感染及生长情况的有效观察. LV结构中U6启动子+前27分子的核苷酸，能将转录蛋白定位于细胞核，发挥有效的沉默作用［8］，而U6启动子又是polⅢ启动子的成员，能非常适合表达siRNA的茎链前体. Galectin?3的shRNA导入细胞后，由Dicer酶加工，生成siRNA结合并激活蛋白激酶PKR和2′5′?AS(寡腺苷酸合成酶)［9］同时LV降低了单独siRNA在细胞内的脆弱性［10］.

　　本组实验将目的基因进行敲减，即Galectin?3蛋白显著降低，其发生可能为激活的蛋白激酶PKR（dsRNA?dependent protein kinase）通过磷酸化转录的起始因子eIf 2a,延迟了蛋白的翻译，这样编码该基因的部分肿瘤遗传学信息受到了影响，表现在肿瘤细胞生长活力（0.4±3.69）%受到抑制，细胞凋亡（68.78%）明显发生，与阴性对照组相比差异显著. 激活蛋白激酶的同时还可导致细胞转录抑制和mRNA非特异性降解，随之引发细胞凋亡，Gil等［11］的研究结论也证实了此观点. 本研究显示：pGCL?GFP/U6 Gal?3shRNA?1转染组mRNA表达量同阴性对照组（0.617%）与空白对照组（0.992%）相比较为0.028%，是由活化的2′5′?AS可通过2′5′?腺苷酸激活的RNase L引起mRNA降解，同时短发夹结构是Dicer核酸酶的底物，引起靶序列的降解［12］也是mRNA降低的原因，结果Galectin?3 mRNA和蛋白质水平均下降. 可为下一步体内研究提供实验依据.

【】
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