射频肝损伤血清诱导兔骨髓干细胞向肝细胞样分化

              作者：杨屹，张明宇，屈波，霍建华，王作仁
【摘要】  目的: 观察射频肝损伤血清能否诱导自体骨髓间充质干细胞（MSCs）向肝样细胞分化,以寻求一种自体肝组织的修复方法. 方法: 射频灭活40%兔肝脏组织,于36 h后取全血及骨髓. 用体外细胞培养技术从骨髓血中分离、纯化兔骨髓MSCs后,于自体射频肝损伤血清中培养,流式细胞仪测定细胞周期并观察其增殖及生长特征,免疫荧光法鉴定细胞性质及功能. 结果: 原代、传代培养及流式细胞仪结果显示,兔骨髓MSCs具有活跃的增殖能力,并在射频肝损伤血清诱导下向肝样细胞分化. 2 wk后免疫荧光染色可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白. 结论: 射频肝损伤兔血清可促进自体骨髓MSCs增殖并向肝样细胞诱导分化,在射频治疗同时行肝样细胞移植修复肝损伤具有可能性. 
【关键词】  射频消融；肝损伤；骨髓间充质干细胞；肝样细胞
　　0引言
　　射频消融(radiofrequency ablation，RFA )是近年来肝脏外科的一项新技术. 对小肝癌治疗效果基本同手术治疗，应用较广,治疗范围逐渐扩大,但同时肝功能损害问题也明显增多. 肝损害可激活机体修复功能,产生、释放的多种因子对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)有诱导分化作用［1］. 利用RFA治疗引起的肝损伤激活MSCs向肝细胞样分化,体外扩增后于再次RFA治疗完成时，经射频治疗针注射通道注入治疗灶周围，或用于RFA治疗时同种异体细胞移植. 由于治疗灶的组织框架及对机体持久刺激作用,有利于植入的肝样细胞趋化损伤区域，爬行替代. 可使RFA治疗范围扩大同时减少肝功能损害.
　　1材料和方法
　　1.1材料健康新西兰大白兔36只(西安大学医学院动物试验中心),2～3 mo龄，雌雄不限，体质量1.5～2.0 kg；低糖DMEM液体培养基，标准胎牛血清（fetal calf serum，FCS），4℃保存备用(美国Hyclone公司)；荧光显微镜, CO2孵箱(上海Heraeus公司)；SW?CJ?IFD型超净工作台，流式细胞仪(美国BECTON DICKINSON公司)；细胞荧光标记物(武汉博士德生物制剂公司)；RF 2000型射频机及10尖锚状电极(美国Radiotherapeutic公司)；Tcs sp2型激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司).
　　1.2方法
　　1.2.1RFA射频肝损伤模型建立及治疗血清制备将兔背部脱毛,置电极板于背部脱毛区,40 mg/kg氯胺酮、12.5 mg/kg氯丙嗪全身麻醉,无菌条件下开腹暴露肝脏,分别置电极针于肝叶中心,展开电极针控制其直径为20 mm,射频仪起始功率为3 W,逐渐增加达30 W,约10～13 min阻抗达100%时功率自动降为0停机,灭活肝组织总体积40%,连续缝合关腹,给于抗感染治疗. 于术后36 h经颈动脉插管取全血,室温静置1 h,离心提取血清,-20℃保存备用.
　　1.2.2兔骨髓BMSCs的分离取新西兰大白兔，用40 mg/kg氯胺酮经耳缘静脉麻醉；无菌操作下以12号骨髓穿刺针刺入兔胫骨骨髓腔，接10 mL注射器(内含3×106 U/L肝素0.2 mL)，抽取骨髓5 mL；加入盛有同体积比重1.073/mL淋巴细胞分离液的试管中，1500 r/min离心20 min,用吸管吸取中间的乳白色有核细胞层，进行原代培养接种.
　　1.2.3兔骨髓MSCs的原代培养和传代培养将经上述培养分离所得的有核骨髓细胞按1×106个接种于25 mL培养瓶内,进一步差速贴壁弃去未贴壁细胞后加入低糖DMEM全培养液(含100 mL/L胎牛血清),于37℃，50 mL/L CO2饱和湿度条件下静止培养；于接种3 d后进行第1次换液,以后隔日换液. 原代培养至贴壁细胞铺满整个培养瓶底部,用2.5 g/L胰酶液将贴壁细胞消化分离(37℃,3～5 min). 按1∶2 比例进行传代接种培养.
　　1.2.4射频肝损伤治疗血清对兔骨髓MSCs的诱导作用将P2 MSCs细胞分为三组,在不同条件下培养诱导. ① 对照组：含100 mL/L FCS的低糖DMEM培养液；② RFA肝损伤治疗血清组(RFA组)： 无血清低糖DMEM培养液加入终浓度为300 mL/L射频肝损伤兔治疗血清；③ 细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)组(HGF组)：含100 mL/L FCS的低糖DMEM 培养液加入肝细胞HGF 20 μg/L及表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF) 20 μg/L,每3 d换液1次. 细胞诱导2 wk后进行鉴定. 细胞培养与诱导过程中用倒置显微镜观察细胞形态,观察诱导后MSCs向肝细胞样分化的情况.
　　1.2.5流式细胞仪测定细胞周期2 wk后取以上各组细胞,2.5 g/L胰酶消化,悬液离心后弃去滤液，每个样本收集约1×106个MSCs，加PBS 1 mL缓冲液洗涤2次，离心,弃上清，加PBS 0.5 mL充分吹散混匀. 将细胞悬液加入700 mL/L乙醇5 mL中,4℃固定过夜. 1200 r/min离心10 min,弃乙醇, PBS洗2次后悬浮于0.5 mL PBS中,加入5 μL Annekin V和碘化丙啶(PI) 1 mL (PI终浓度为50 g/L),室温避光反应30 min,上流式细胞仪检测. Multcycie软件处理结果.
　　1.2.6免疫荧光法检测肝细胞标志物取对照组未分化细胞与诱导分化后的细胞爬片进行免疫荧光法染色检测肝细胞标志物CK18和白蛋白. 用PBS洗去培养液,40 g/L多聚甲醛固定液固定15 min后洗涤,滴加50 mL/L山羊血清，室温20 min，PBS清洗；分别加入鼠抗兔CK18 (1∶200) 或白蛋白(1∶100) 的 mAb. 作为一抗,4℃过夜孵育,PBS洗涤2次,再加入FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶200)作为检测白蛋白的二抗以及TRITC标记的羊抗鼠IgG(1∶100)作为检测CK18的二抗,孵育60 min,反复洗涤后,用激光扫描共电聚焦显微镜观察并拍照. 标本自发荧光对照组,抗原对照组在荧光显微镜下观察有无荧光表达.
　　统计学处理： 实验数据以Mean±SD表示，采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义.
　　2结果
　　2.1MSCs体外诱导过程的形态学观察贴壁后的MSCs在培养初期大多呈现内皮细胞样的梭形或纺锤形,贴壁较紧,可见克隆形成,1 wk后可以观察到细胞象成纤维细胞样变长,成漩涡状生长(图1A),2～3 wk细胞铺满培养板底. 取出该细胞P2在RFA治疗血清培养液或HGF和EGF诱导2 wk后,梭形或纺锤形细胞逐渐变成肝细胞样类圆形或多角形,核质比减小,且贴壁能力减弱,换液时诱导孔中细胞减少,而对照组细胞仍保持MSCs的梭形或纺锤形,贴壁较紧(图1B).
　　A: 第2代； B: 第7代.
　　图1兔骨髓间充质干细胞×10（略）
　　2.2流式细胞仪测定细胞周期对照组中S+G2+M期细胞数为(24.14±2.1)%，G1/G2为1/2.13，细胞凋亡率为2.4％(图2A)，说明MSCs的增殖不明显. 而RFA组MSCs增殖明显，S+G2+M期细胞数为(41.16±1.7)%，G1/G2为1/1.85，细胞凋亡率为8.31％ (图2B). HGF组MSCs增殖明显，S+G2+M期细胞数为(36±1.3)%，G1/G2为1/1.53，细胞凋亡率为2.27％(图2C). 结果显示，射频肝损伤治疗血清及HGF，EGF能明显诱导并促进MSCs增殖，两者与对照组相比较差异具有统计学意义（P<0.05）. 进入S期细胞增多伴有细胞凋亡增加可能与细胞增殖平衡机制有关.
　　A： 对照组； B： 射频肝损伤血清组； C： 细胞生长因子组.
　　图2兔骨髓基质干细胞的细胞周期流式细胞仪测定（略）
　　2.3免疫荧光染色诱导分化后的肝细胞样类圆形、多角形细胞经免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察可见细胞胞质中FITC标记的白蛋白表达绿色荧光(图3A)，胞膜内TRITC标记的CK18表达红色荧光(图3B). 而未诱导的对照组细胞则呈阴性反应. 抗原对照组(图3C,D)，阻抑试验组荧光显微镜下观察均无荧光现象.
　　A： FITC标记的白蛋白表达； B： TMRITC标记的CK18表达； C： 抗原对照组FITC标记的白蛋白无表达； D： 抗原对照组TRITC标记的CK18无表达.
　　图3肝样细胞免疫荧光染色白蛋白及CK18鉴定×40（略）
　　3讨论
　　RFA可以使肿瘤组织凝固坏死,对小肝癌治疗效果基本同手术治疗，与其他治疗如经皮乙醇注射及经皮醋酸注射治疗相比有更好疗效［2］,临床应用日趋普遍. 但随之而来的肝功能损害问题也与日增多. 肝损伤时释放各种因子诱导MSCs分化，而BMSCs具有自我复制和高度增殖的能力和多向分化性［3］,将其应用于细胞替代及组织器官再造等治疗，安全性高,取材容易便于自体移植,为肝脏疾病的细胞移植治疗提供了可利用的细胞库.
　　有研究［4］表明,骨髓来源的干细胞具有向肝脏干细胞亦称卵圆细胞(Oval cells)分化潜能；MSCs还可以分化为血管内皮细胞，使干细胞存在内环境得到改善，有利于其生存及替代修复，更重要的是,采用患者自身的MSCs，可以避免组织器官移植后的免疫排斥反应，可避免动物血清引起的变型 Creutzfeldt?Jakob 病及牛血清蛋白引起的移植后免疫排斥反应.
　　目前,国内外学者多采用与肝细胞共培养［5］或HGF为主的多个细胞因子组合来进行诱导分化［6-8］获取肝样细胞，然而肝细胞获取困难并需要较高浓度HGF(20 μg/L)及EGF(20 μg/L). 我们在RFA治疗基础上较早提出用RFA治疗血清做为诱导剂,诱导预实验中发现RFA治疗血清浓度与诱导能力在50～300 mL/L成正相关,当血清浓度大于300 mL/L时，这种相关趋势明显减弱，从诱导效果及成本综合考虑选取300 mL/L浓度进行诱导兔MSCs,细胞形态发生了变化,即细胞贴壁伸出的长触角回缩,有多边形、类圆形变化趋势,细胞贴壁能力减弱［9］. 加入HGF和EGF诱导后,细胞呈肝细胞样圆形、多角形［10］. 流式细胞仪测定细胞周期表明细胞分裂增生较前活跃，RFA治疗血清较生长因子组明显. 进入S期细胞增多伴有细胞凋亡增加可能与细胞增殖平衡机制有关. CK18，白蛋白是公认的肝细胞特异性分泌产物. 为进一步鉴定诱导细胞功能,我们用肝细胞标志物CK18和白蛋白抗体进行免疫光染色. 诱导后的细胞CK18和白蛋白抗体反应阳性,这提示其具有部分肝细胞特性. 但RFA在机体荷瘤状态下能否激发MSCs增生、分化还需进一步研究.
　　综上所述，RFA治疗血清或HGF的培养体系均能有效诱导MSCs向肝前体细胞分化且具有一定功能，由于RFA治疗血清中含有众多因子及机体应激修复时产生HGF，FGF?4，EGF等多种物质，保留与体内相似的内环境,RFA血清较HGF的培养体系能更有效诱导MSCs向肝前体细胞分化. 实验模拟机体在RFA治疗时发生的变化，可将外科微创治疗与干细胞组织工程结合，使RFA治疗同时进行肝损伤的预防、修复成为可能.
【】
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