深低温冷冻对鼠异体气管移植的免疫调节作用

【关键词】  深低温冷冻；气管移植；免疫

　　通过大鼠冷冻气管移植术后不同时间段移植体的大体及病理改变，了解深低温冷冻对气管移植体各组织活性及免疫原性影响，为今后冷冻气管移植临床应用提供依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　SD大鼠32只，Wister大鼠64只，雄性，体质量200~250 g，购自第四军医大学动物实验中心.

　　1.2方法

　　1.2.1同种异体移植气管段的获取按0.15 mg/kg肌肉注射速眠新将32只SD大鼠麻醉后，无菌切取颈段气管. 将切取气管体用生理盐水冲洗，并在混合抗生素溶液中（青霉素和庆大霉素）浸泡2 min，标本于10 min内降温冷冻保存. 深低温冻储2 mo后，移植前将装有气管段冷冻管从液氮中取出，置于37℃恒温水浴箱中，摇动，使气管段解冻复温.

　　1.2.2实验动物处理将64只Wister大鼠按所接受移植体是否在术前行深低温冷冻及术后处死时间不同分为8组（冷冻组C1~C4和未冷冻组F1~F4），每组8只. 各组均将气管移植体移植于实验动物腹腔大网膜中，分别于术后1，4，8，12 wk处死实验动物，行大体及病检查，组织学半定量测定上皮及软骨情况，免疫组化法判断各组的免疫排斥反应情况. 实验动物分笼饲养，全营养饲料购自第四军医大学动物实验中心.

　　1.2.3气管移植Wister大鼠行速眠新（0.15 mg/kg）肌肉注射全身麻醉. 仰卧位固定手术台上，剪除上腹毛发，碘酒、700 mL/L乙醇消毒，铺无菌洞巾，于上腹部旁正中行纵形切口，长约1 cm. 分离皮下，剪开肌肉筋膜组织，钝性分离肌肉组织，剪开腹膜，显露腹腔，提出部分大网膜. 打开冷冻管取出气管移植体. 用生理盐水反复冲洗干净，浸泡于混合抗生素溶液（20万U/L青霉素和200 mg/L庆大霉素）中5 min. 将气管移植体包于大网膜中，用3~0无损伤缝合线缝合大网膜，共三针将气管移植体固定于大网膜中，后将带移植体大网膜还纳腹腔，缝合腹部切口. 未冷冻组即行未冷冻气管段同种异体、异位移植组中，将新鲜取出的气管段经大量生理盐水冲洗后浸泡于混合抗生素溶液，其余步骤与冷冻组相同. 所有动物均于术后立即给予青霉素肌注，于术后给予肌肉注射青霉素1万U，每日2次，共7 d. 各组接受相同喂养. 各组实验动物在预杀期处死［1］.

　　统计学处理：计量数据用x±s表示，组间比较采用ANOVA，组间方差不齐时采用Kruskal?Walllis H检验. 采用SPSS11.5统计软件包处理数据，以P<0.05为有统计学意义.

　　2结果

　　2.1实验动物的生存状况和存活率各组实验动物均未发生麻醉及手术意外，术后生活状态良好，均未发生切口感染等并发症，观察期内存活率为100%.

　　2.2移植后气管的大体表现各组气管移植体外覆大网膜血管丰富，网膜组织与气管移植体粘连紧密. 各组未见软骨环有断裂或被完全吸收现象. 冷冻组各气管移植体管壁略变薄，管腔无明显狭窄，狭窄程度均未超过20%，未冷冻组各气管移植体管壁增厚，F3，F4组移植体管腔明显狭窄超过30%，其中F4组移植体管腔狭窄超过50%. 可见，冷冻组与未冷冻组相比，各气管移植体管腔无明显狭窄（P<0.05）.

　　2.3病检查上皮及气管腺破坏情况：冷冻组上皮积分劣于未冷冻组上皮积分，移植之前冷冻组上皮细胞多数纤毛缺失，正常假复层柱状纤毛上皮已经由鳞状上皮取代，气管腺几乎消失. 移植后1 wk气管体内表面主要由单层上皮覆盖，气管腺己消失，4 wk后气管体内表面几无上皮覆盖. 未冷冻组移植后1 wk气管上皮主要为假复层柱状纤毛上皮及鳞状上皮覆盖，多数气管腺萎缩，4 wk后纤毛上皮脱落，主要为鳞状上皮覆盖，气管腺消失. 8 wk上皮细胞破坏，表皮脱落（>70% ），气管腺消失. 而在12 wk后，未见有黏膜上皮细胞存活. 各时间段横向比较冷冻组上皮积分劣于未冷冻组上皮积分.

　　2.4软骨情况在移植之前冷冻组可见少部分软骨细胞已有细胞核固缩、核溶解现象，其比例为（76±9）%，移植后1，4，8，12 wk比例有差异. 术后冷冻组各时间段软骨错位、塌陷软化不明显，未冷冻组软骨相应破坏随时间的增长明显，术后12 wk时，软骨形态结构积分为0.92±0.21. 实验表明，冷冻组在保持软骨结构方面优于未冷冻组（P<0.05）.

　　2.5气管黏膜下层及细胞间质情况各组气管环间及纤维外膜层见新生毛细血管，术后4 wk各组黏膜下层可见新生毛细血管生成，冷冻各组毛细血管通畅，未冷冻组于第4 wk可见少量新生毛细血管内有血栓生成，于第12 wk可见40%以上毛细血管有血栓生成，个别新生毛细血管上皮坏死，冷冻各组在单核细胞浸润方面不及未冷冻组明显，各组相应积分随术后时间延长而增长. 各时间段横向比较冷冻组单核细胞浸润面积积分优于未冷冻组（P<0.05）.

　　3讨论

　　深低温冷冻在保存气管移植体的同时，对上皮、软骨及间质细胞均有损伤，这种作用，可降低免疫排斥反应，又对气管移植体有破坏作用［2-3］. 本实验符合上述观点. 呼吸道上皮有良好再生和覆盖管腔结构潜力. Mukaida等［4］研究表明冷冻后气管移植体在第20日后表面无上皮覆盖，在第60日移植体被受体柱状纤毛上皮所覆盖. 我们采用异体异位移植，发现气管表面上皮在移植后进行性缺失，证明原位移植后的上皮再生不是来自供体. 上皮虽对气管功能有关键作用，但移植后气管上皮短期内缺损不可避免，冷冻加快这种缺损，为原位移植后受体上皮早期再生提供条件.

　　冷冻气管抗原性下降原因与冻融过程造成的上皮损伤或软骨细胞活性下降有关［5］，另一个原因是破坏了体内树突状细胞（DC）. 本结果支持上述观点. 我们发现，未冷冻组单核细胞浸润积分高于冷冻组，气管及黏膜下层积分与炎症浸润积分呈负相关. 冷冻组CD3阳性细胞浸润积分低于未冷冻组，软骨内CD3阳性细胞浸润积分在8个组内均较低，但在未冷冻组术后4，8，12 wk时可见部分CD3阳性细胞浸润，说明软骨的抗原性弱，不易发生排斥反应. 同时表明，如果软骨层无DC，那么DC并不是同种异基因移植免疫反应中惟一的抗原提呈细胞. 综上所述，我们在实验中证明冷冻在保存及降低免疫排斥反应方面有作用. 冷冻虽对气管上皮及软骨等组织产生一定损伤，并不影响气管管腔，相反其早期供体黏膜上皮损伤作用可能会为来自受体早期黏膜上皮再生提供条件. 实验中我们观察到冷冻组软骨形态结构保持更好，估计与再生血管发生血栓现象少有关.

【】
  　　［1］赵晋波, 李小飞, 刘锟，等. 同种异体近交系小鼠原位气管移植模型的建立［J］. 第四军医大学学报, 2007, 28(6): 540-543.

　　［2］曾勇, 文卫平, 王跃建. 同种异体气管移植［J］. 国际耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2007, 31(5): 272-274.

　　［3］高静, 周刚. 深低温冻储在大鼠同种异体气管移植中免疫抑制作用［J］. 实用美容整形外科杂志, 2005, 16(4):249-252.

　　［4］Mukaida T, Shimizu N, Aoe M, et al. Origin of regenerated epithelium in cryopreserved tracheal allotransplantation［J］. Ann Thorac Surg, 1998, 66(1): 205-208.

　　［5］闫小龙, 李小飞, 刘勇，等. 深低温冷冻对rhBMP?2诱导犬气管移植体软骨再生的影响［J］. 第四军医大学学报, 2005, 26(2): 160-163.