银杏叶提取物对荷瘤小鼠免疫功能的影响

【摘要】  目的 通过药理实验证明，银杏叶提取物对荷瘤小鼠免疫功能的影响，从而说明银杏叶提取物能提高机体的免疫功能。方法 通过对荷瘤小鼠胸腺指数、淋巴细胞转移功能、NK细胞活性、TNF活性、IL-2诱生水平等免疫指标的测定，从而得出银杏叶提取物对机体免疫功能的影响。结果 证明银杏叶提取物具有增强机体的免疫功能的作用。结论 银杏叶提取物可显著提高荷瘤小鼠的淋巴细胞转化功能；低剂量可增强NK细胞活性；可显著增强TNF活性，且具有剂量依赖性；可显著增强IL-2的诱生水平，且具有剂量依赖性

【关键词】  银杏叶提取物 S180细胞 血清药 杀伤细胞 天然 肿瘤坏死因子 白介素2

    银杏叶为银杏科银杏属植物银杏（Ginkgko biloba L）的叶子。秋季采集，晒干。气微，味微苦。归心、肺经。传统上用于冠心病、心绞痛、高血脂等症。主要化学成分为黄酮类、内酯类化合物。近几年研究报道银杏叶提取物不但具有扩张血管的作用，还有抗炎、镇痛、抗衰老、降血脂、抗肿瘤作用，许多医药学古籍记载了银杏叶具有治疗膀胱肿瘤和消化道肿瘤的作用。民间就有食用银杏叶治疗癌症的做法。本组用荷瘤小鼠做实验，探讨银杏叶提取物对机体免疫功能的影响及其作用机制。

    1  仪器与材料

光学显微镜：日本Olympus；高速离心机：日本SAKURA；电磁搅拌机：日本SAKURA；天平：沈阳龙腾称量仪器有限公司；CO2孵箱：美国Back tel型号WJ-301T；RPMI-1640培养基：美国GIBCO公司；S180细胞：延边大学药学院药理教研室；昆明种小白鼠（体重18～22 g，雌雄各半，普通级）：延边大学药学院实验动物中心；新生小牛血清：北京鼎国生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO）：Sigma公司；刀豆蛋白A（ConA）：Sigma公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）：Genview公司；胰蛋白酶：Genview公司。

    2  方法

    2?1  银杏叶提取物的制备  取秋季新采集已晒干的银杏叶2 kg，切碎，以95%乙醇10000 ml浸泡过夜，再加热至60 ℃，温浸5 h，倒出提取液，再加入95%乙醇10000 ml重复提取一次，然后再用70%乙醇10000 ml煮沸一次，保持沸腾约2 h，将三次提取所得浸出液合并后减压浓缩，得棕绿色黏稠液状的总浸膏。总浸膏加适量水溶解，分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。每溶剂萃取4次，每次1000 ml。分别得石油醚萃取物0.242 kg，氯仿萃取物0.324 kg，乙酸乙酯萃取物0.331 kg。取乙酸乙酯萃取物溶解后上硅胶柱，以氯仿-甲醇（4∶1）洗脱，分别收集绿色、黄绿色、红色、棕色和褐色五条色带的流份做初步的细胞毒性实验，结果以红色流份的抑制细胞增殖效果最为明显，因此将红色流份作为本实验的有效成分，将其收集于旋转蒸发瓶中蒸干，过滤除菌，备用。

    2?2  小鼠胸腺指数的测定［1］  将小鼠处死，取胸腺称重，胸腺指数。

    2?3  小鼠脾细胞悬液的制备［2］  将小鼠处死，取脾脏，研磨，沙网过滤（200目），加入红细胞裂解液，裂解3 min，1500 r/min离心8 min，取出淋巴细胞，生理盐水冲洗2次，

    作者单位： 1 134300 吉林白山，白山市食品药品检验所

    2 134300 吉林白山，白山市中心

    800 r/min离心10 min，用RPMI-1640培养液调细胞浓度为5×106/ml，37 ℃ 5%CO2饱和湿度培养，备用。

    2?4  淋巴细胞转化功能的测定［2］  将制备的小鼠脾细胞悬液用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为5×106/ml，加入于96孔培养板，100 μl细胞悬液/孔。加入浓度为2.5 μl/ml的ConA，100 μl/孔，于37 ℃ 5%CO2培养箱内培养48 h后，弃上清，每孔加入MTT（5mg/ml）试液10 μl，继续培养4 h，弃上清，每孔加入DMSO 100 μl，振荡10 min，用酶联免疫检测仪测在570 nm处测吸收度。

    2?5  NK细胞活性的测定［3］  采用MTT方法测定，将制备的脾细胞悬液调浓度为3.1×106/ml。取传代两次且生长良好的靶细胞Yac-1，用培养液调浓度为1.4×105/ml，使得效应细胞和靶细胞的比例为25∶1。将两种细胞接种于96孔培养板，每只小鼠脾细胞悬液均设3孔，其中2孔加入效应细胞和靶细胞，各100 μl，另1孔为效应细胞对照，加入效应细胞和RPMI-1640（含10%小牛血清）各100 μl。整批实验还设3孔靶细胞对照，加入靶细胞和RPMI-1640各100 μl。上述各孔于37 ℃ 5%CO2条件杀伤4 h后，弃上清，每孔加入MTT（5 mg/ml）试液10 μl，继续培养4 h，弃上清，每孔加入DMSO 100 μl，振荡10 min，用酶联免疫检测仪在570 nm处测吸收度。

    2?6  TNF活性测定［4］

    2?6?1  TNF的诱生  将制备的小鼠脾细胞悬液用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×106/ml，接种于24孔培养板，每孔500 μl，每孔再加终浓度为5 μg/ml的ConA，500 μl/孔，37 ℃ 5%CO2培养箱内培养48 h后，吸出细胞培养上清，12000 r/min离心15 min，取上清液，备用。

    2?6?2  TNF活性测定  将生长良好的L929细胞用0.25%胰酶消化液消化，用RPMI-1640培养液配制成4×105/ml，接种于96孔培养板100 μl/孔，同时将待测样品也加入培养板100 μl/孔，37 ℃ 5%CO2培养箱内培养48 h后，轻轻吸去上清液100 μl，加入MTT（1mg/ml）试液 100 μl，37 ℃ 5%CO2培养箱内培养2 h后，2000 r/min离心5 min，吸弃上清液，每孔加DMSO 100 μl，作用30 min，用酶标测定仪测570 nm处的吸收度。

    2?7  IL-2诱生水平的测定［5］

    2?7?1  小鼠脾细胞悬液IL-2的诱生  将制备的小鼠脾细胞悬液用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×106/ml，接种于24孔培养板，每孔500 μl，每孔再加终浓度为5 μg/ml的ConA，500 μl/孔，37 ℃ 5%CO2培养箱内培养48 h后，吸出细胞培养上清，12000 rpm离心15 min，取上清，备用。

    2?7?2  诱生水平的测定  取传代培养48 h的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000 r/min离心5 min，再用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×105/ml，接种于96孔培养板100 μl/孔，同时将待测样品也加入培养板100 μl/孔，37 ℃ 5%CO2培养箱内培养48 min后，轻轻吸去上清液100 μl，加入MTT（1mg/ml）试液 100 μl，37 ℃ 5%CO2培养箱内培养2 h后，2000 r/min离心5 min，吸弃上清液，每孔加DMSO 100 μl，作用30 min，用酶标测定仪测在570 nm波长处测吸收度。

    3  结果

    3?1  银杏叶提取物对荷瘤小鼠胸腺重量的影响  结果见表1。 表1  银杏叶提取物对荷瘤小鼠胸腺重量的影响注：与肿瘤模型组比较，△P＜0?05；与正常组比较，●P＜0?05

    肿瘤模型组小鼠胸腺指数明显低于正常组，而三个剂量的提取物能明显提高荷瘤小鼠的胸腺指数，使其恢复到正常水平，但各个提取物并未表现出剂量依赖性。

    3?2  银杏叶提取物对淋巴细胞转化功能的影响  结果见表2。 表2  银杏叶提取物对淋巴细胞转化功能的影响注：与正常组比较，△P＜0?05；与肿瘤模型组比较，●P＜0?05；与正常组比较◆P>0.05

    肿瘤模型组小鼠的淋巴细胞转化功能明显低于正常组，用CTX的小鼠使淋巴细胞转化功能进一步降低。而提取物可明显提高荷瘤小鼠的淋巴细胞转化功能，具有剂量依赖性，其中高、中剂量组与正常组比较无明显差异。

    3?3  银杏叶提取物对NK细胞活性的影响   结果见表3。 表3  银杏叶提取物对NK细胞活性的影响 注：与正常组比较，△P＜0?05；与正常组比较，●P>0.05

    肿瘤模型组与正常组比较有显著性差异，低剂量的提取物能提高荷瘤小鼠的NK细胞活性，达到正常小鼠的水平，而中、高剂量的提取物降低NK细胞活性。

    3?4  银杏叶提取物对小鼠TNF活性的影响  结果见表4。 表4  银杏叶提取物对小鼠TNF活性的影响注：与肿瘤模型组比较，△P＜0?05；与正常组比较，●P>0.05

    银杏叶提取物低剂量组能提高荷瘤小鼠TNF活性，但不能达到正常组水平，中、高剂量组能提高到正常组水平，具有剂量依赖性。

    3?5  银杏叶提取物对小鼠脾细胞IL-2（诱生）水平的影响  结果见表5。表5  银杏叶提取物对荷瘤小鼠脾细胞IL-2  诱生水平的影响注：与肿瘤模型组比较，△P＜0?05；与正常组比较，●P>0.05

    银杏叶提取物能显著提高荷瘤小鼠脾细胞IL-2诱生水平，其中高剂量组能提高到正常组的水平。

    4  讨论

　　NK细胞不需预先致敏即能分泌细胞毒性因子杀伤肿瘤细胞，抗瘤谱广，无肿瘤特异性和MHC限制性，也能释放IFN-γ、IL-1、IL-2等细胞因子来发挥免疫调节作用，所以是机体抗肿瘤生长、扩散和转移的天然防御系统［6，7］。有研究表明［8］，随着NK细胞活性的降低，肿瘤发生率有所增加，因此，测定机体的NK细胞活性及提高NK细胞活性，对于肿瘤的预防治疗和预测都有重要价值。本实验结果表明，低剂量组的NK细胞活性与肿瘤模型组比较具有很大的提高，与正常组比较无差异。TNF是由单核-巨噬细胞系统分泌的一种细胞因子，具有多种生物学活性。如能够激活T细胞、刺激B细胞产生抗体、刺激单核细胞等产生细胞因子、促进白细胞杀死微生物及杀灭肿瘤细胞等功能。其最大特点是能选择性杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖，而不影响正常细胞的生长、分化和代谢功能［9］。本实验结果表明，肿瘤模型组的TNF活性较正常组明显下降，而三个剂量组TNF活性与肿瘤模型组比较具有很大的提高，与正常组比较无差异，然而，也有报道S180细胞的小鼠TNF活性非但没有正常小鼠下降，而且有上升。至于二者矛盾之处，有待于进一步研究。IL-2是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有多种生物学活性。如能够促进T细胞增殖及维持T细胞体外长期生长、促进B细胞增殖分化和刺激NK细胞生长，在机体的免疫应答和调节中起重要作用［10］。另有学者表明［11］，IL-2能促进外周血单核细胞产生TNF，从而增强抗肿瘤的作用。由于IL-2的含量与机体的免疫功能相关，尤其是与细胞免疫功能密切相关，因此可将IL-2的产生作为细胞免疫效应的主要指标。本实验结果表明，肿瘤模型组脾细胞的IL-2诱生水平明显低于正常组，这与国内外学者的研究结果相一致，而三个剂量组的IL-2诱生水平与肿瘤模型组比较可以明显提高，且随剂量增加而增加，直至达到正常组的水平。

    5  小结

以上结果表明，银杏叶提取物可显著提高荷瘤小鼠的淋巴细胞转化功能；低剂量可增强NK细胞活性；可显著增强TNF活性，且具有剂量依赖性；可显著增强IL-2的诱生水平，且具有剂量依赖性。

【】
  1 王玲，李俊，李欣，等.枸杞多糖2对辐射损伤小鼠免疫功能恢复的影响.上海免疫学杂志，1995，15（4）:209-211.

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5 杨英，李剑，李叔田.白细胞介素-2检测方法的比较研究.广州医学院学报，1995，23（2）:17-20.

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7 宋义平，刘彩云，周刚，等.牛膝多糖对小鼠细胞免疫功能的影响.中药新药与临床药理，1998，9（3）:158-161.

8 宁安红，曹倩，黄敏，等.灵芝多糖对荷瘤小鼠免疫系统的影响.中国微生态学杂志，2004，16（1）:13-14.

9 Ichikawa T，Satou K，Kobayashi Y，et al.3D?CT cystography with perspective volume?rendering.Nippon Igaku Hoshasen Gakkai Zasshi，1998，58（6）:287-289.

10 张杰玉，刘君炎，夏丰年，等.BCG?PSN对荷瘤小鼠IL-2水平及肿瘤生长的影响.湖北医科大学学报，1997，18（4）:303-307.

11 张占英，张滦生，李春兰，等.胸膜渗液中白细胞介素2及杀伤细胞毒因子活性的研究.苏州医学院学报，1995，15（3）:503-504.