RNA结合蛋白Sam68 mRNA在原发性肝癌中的表达及意义

         作者：马高祥 傅利锋 王涌 吴育连    

【摘要】  目的 探讨RNA结合蛋白Sam68 mRNA在人原发性肝癌组织中的表达及意义。方法 选取20例原发性肝癌的肿瘤组织及相应癌旁组织，采用TRIzol一步法提取总RNA，采用RT-PCR法检测Sam68 mRNA在肝癌组织及相应癌旁组织中的表达。 结果 PCR产物电泳显示肝癌组织中Sam68 mRNA平均表达强度为60.71％±9.26％，相应癌旁组织中Sam68 mRNA平均表达强度为76.98％±11.61％，经配对t检验，P＜0.05，具有统计学差异。 结论 与相应癌旁组织相比，人原发性肝癌组织中Sam68 mRNA的表达明显降低，提示在人原发性肝癌组织中Sam68的表达在转录水平受到明显抑制。

【关键词】  肝癌 RNA结合蛋白 聚合酶链反应

　　【Abstract】Objective  To discuss the expression of sam68 in primary heptocarcinoma ant its significance.. Methods  20 cases of tumor tissues and corresponding near-tumor tissues of human primary hepatocellular carcinoma were collected. Total RNA was extracted from specimens using TRIzol one-step method, the expression level of sam68 in both of tumor tissues and corresponding near-tumor tissues were observed with reverse tranctiption-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results  Examined by ultraviolet spectrophotometer, the mean expression level of sam68 was 60.71％±9.26％ in tumor tissues, and 76.98％±11.61％ in near-tumor tissues. By match data test, P＜0.05, indicated the difference had statistic significance. Conclusion  Comparing to responding near-tumor tissues, the amounts of sam68 mRNA expression were lower in human primary hepatocellular carcinoma. It shows that the expression of RNA-binding protein sam68 is inhibited at transcription level in human hepatocellular carcinoma.

　　【Key word】hepatocellular carcinoma  RNA-binding protein   polymerase chain reaction(PCR)   

　　Sam68是STAR蛋白家族的代表成员之一, 目前关于Sam68的报道仅限于国外研究，且大多以序列结构分析及相关配体检测为主，而Sam68与各种恶性肿瘤的相关性研究较少，在原发性肝癌中的表达情况国内外少见正式报道。

    本研究通过半定量RT-PCR技术，首次明确了RNA结合蛋白Sam68 mRNA在人原发性肝癌中的表达情况，为进一步研究STAR蛋白在肿瘤形成和过程中的作用机制提供了一定的理论基础。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料 

　　20例原发性肝癌的肿瘤组织及相应癌旁组织取自浙江大学医学院附属二院病理科新鲜冰冻标本,主要试剂TRIZOL （Invitrogen公司）MMLV（逆转录酶）和Taq DNA polymerase     （Promega公司）dNTP（上海博亚生物技术公司），DEPC （GIBCO公司） Agarose （AMRESCO公司）DNA Marker DIL2000（Takara公司） 乙醇、氯仿、异丙醇、溴化乙锭及其他试剂均为国产或进口纯试剂。

　　1.2  方法 

　　(1)细胞总RNA提取（RNA extraction）取20例原发性肝癌的肿瘤组织及相应癌旁组织分成20对样本，碾磨成粉,采用TRIzol一步法提取总RNA。(2)RNA质量检测 取RNA 2μl，加98μl DEPC水，混匀，紫外分光光度仪比色测OD值，A260/280比值，以及所抽提的总RNA浓度(3)RT-PCR法检测Sam68的表达 参照国外［１］设计Sam68及β-actin引物各一对，(引物序列见表1，由上海生工生物技术工程服务有限公司合成。)PCR扩增产物片段分别为Sam68 530bp，β-actin 300bp。 
     
    取各样本组RNA行常规RT-PCR扩增，RT参数设置按照说明书，PCR参数设置如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s，70℃延伸1min，Sam68和β-actin分管扩增，均为35循环；再72℃最终延伸10min，PCR产物4℃保存并测序(交由生物公司代为测序)。
     
　　取10μl PCR扩增产物，以1.8％琼脂糖凝胶电泳，图像扫描保存，用Band Leader（Ver3.00）电泳图像分析软件，对电泳条带的光密度进行分析，以CAR/β-actin的光密度比值作为相对定量，表示Sam68 mRNA的表达强度。表1  PCR引物序列（略）

　　1.3  统计学分析 

　　每个样本重复3次PCR，取Sam68/β-actin的光密度比值的均值为统计数据。以SPSS 11.5统计学软件进行分析，采用配对资料t检验。P<0.05为差异有显著性意义。

　　2  结果

    对总RNA用紫外分光光度计进行检测，A260/A280＞1.8，证明提取的总RNA纯度较高，无蛋白质污染。经DNA测序，PCR产物序列与Sam68基因序列完全吻合，证实为Sam68基因扩增产物。
    PCR产物电泳显示(见图2,图3)本组20例，除2例呈阴性外，其余18例肝癌及相应癌旁组织均检出Sam68 mRNA表达。其中，肝癌组织中Sam68 mRNA平均表达强度为60.71％±9.26％，相应癌旁组织中Sam68 mRNA平均表达强度为76.98％±11.61％，经配对t检验，P＜0.05，具有统计学差异。  

　　3 讨论

    Sam68作为STAR蛋白家族的代表成员之一，是20世纪末新发现的一种RNA结合蛋白。Courtneidge和shalloway通过研究发现该RNA结合蛋白的分子量是68Kda，在有丝分裂过程中是Src的底物，因此将其命名为Sam68［２，３］。Sam68主要定位于核内［４］,最新研究显示，Sam68与肿瘤形成密切相关。Liu等［５～７］通过随机纯合子敲除法，用逆转录病毒为介导将反义RNA导入鼠纤维母细胞系NIH3T3，产生一种染色体基因失活的特殊表型。检测显示，该特殊表型的NIH3T3细胞所表达的Sam68水平不到野生型的25%，同时这些细胞的软琼脂集落形成率大大增加，表现出非锚着依赖性生长，缺乏细胞接触抑制，并能够在裸鼠中形成转移性肿瘤。若将Sam68表达水平从25％人为提高到野生型的50％左右，可逆转部分细胞的肿瘤化生长状态，但这种逆转是不彻底的。上述研究提示Sam68可能是一种肿瘤抑制剂。

    本研究采用半定量RT-PCR技术，首次对人原发性肝癌及相应癌旁组织中Sam68 mRNA的表达情况进行了检测。结果显示，肝癌组织中Sam68 mRNA平均表达强度为(60.71％±9.26)％，相应癌旁组织中Sam68 mRNA平均表达强度为(76.98％±11.61)％，经配对t检验，两组差别有统计学意义。从而表明与相应癌旁组织相比，人原发性肝癌组织中Sam68 mRNA的表达明显降低，提示在人原发性肝癌组织中Sam68的表达在转录水平受到明显抑制。这一结果与国外研究一致［５～７］。值得一提的是，本组中有2例样本，无论是肝癌组织还是相应癌旁组织，均未检测到Sam68 mRNA的表达，推测癌旁组织可能存在Sam68基因缺失突变，或处于癌前期病变（2例均存在明显肝硬化），Sam68 mRNA表达已经明显受抑，因样本量较少，无法得出结论。

    尽管有研究表明Sam68在细胞增殖，分化和肿瘤形成过程中发挥重要作用，但确切的生物学机制尚不清楚，其在肿瘤发生过程中到底扮演何种角色等问题，均有待于进一步的深入研究。

    与相应癌旁组织相比，人原发性肝癌组织中Sam68 mRNA的表达明显降低，提示在人原发性肝癌组织中Sam68的表达在转录水平受到明显抑制。

【】
  　　1 J Kool, V W， Zanne C. Terleth. Down-regulation of T-STAR, a growth inhibitory protein, after SV40-mediated immortalization. Cell Growth Differ, 2001, 12: 535～541.

　　2 M F Moran, CA Koch, D Anderson, et al. Src homology region 2 domains direct protein-protein interactions in signal transduction. Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A, 1990, 87: 8622～8626

　　3 S Fumagalli, NF Totty, JJ Hsuan, et al. A target for Src in mitosis. Nature, 1994, 368: 871～874.

　　4 A Weng, SM Thomas, RJ Rickles, et al. Identification of Src, Fyn, and Lyn SH3-binding proteins: implications for a function of SH3 domains. Mol. Cell. Biol, 1994,14: 4509～4521.

　　5 C.Y. Liu, A. Flesken-Nikitin, S. Li, et al. Inactivation of the mouse Brca1 gene leads to failure in the morphogenesis of the egg cylinder in early postimplantation development. Genes Dev, 1996, 10: 1835～1843.

　　6 K Liu, L Li, PE Nisson, et al. Neoplastic transformation and tumorigenesis associated with sam68 protein deficiency in cultured murine fibroblasts. J. Biol. Chem, 2000, 275: 40195～40201.

　　7 Q Liu, U Fischer, F Wang, et al. The spinal muscular atrophy gene product, SMN, and its associated protein SIP1 are in a complex with spliceosomal snRNP proteins. Cell, 1997, 90: 1013～1021