人巨细胞病毒耐药性研究进展
【关键词】 人巨细胞病毒
人巨细胞病毒(CMV)是导致免疫缺陷患者发病和死亡的一种重要的病毒；该病毒感染能引起肺部、胃肠道感染、视网膜炎等疾病，并可能与移植受者发生的急、慢性排斥反应有关：通过产生一系列细胞因子、化学因子和生长因子共同作用于移植物，导致移植物功能丧失。当前能该病毒的药物很少，主要有核苷拟似物更昔洛韦、核苷酸拟似物西多福韦和焦磷酸盐拟似物膦甲酸钠［1］。目前对CMV感染的治疗方案［2］：(1)标准治疗：当CMV感染活动并出现相应的症状和体征时进行治疗；(2)预防性治疗：在发现CMV感染之前即给予预防性治疗措施；(3)先占性治疗：定期监测CMV活动性感染，并在症状发生之前给予治疗；(4)延期治疗：在早期进行重点监测，发现活动性CMV感染后延长其治疗时间，并减少免疫抑制剂。自从1986年分离到第一例耐更昔洛韦的CMV病毒株后，随着抗病毒药物的使用增加、较低的药物浓度以及患者体内高病毒负荷状况，耐药病毒株的数量也逐渐增多。CMV耐药性的出现是患者疾病进展和治疗失败的一个重要因素，因此这一问题受到了临床广泛的关注。
1 流行病学
目前CMV耐药株的报道针对获得性免疫功能丧失综合征(AIDS)患者的较多，但由于高活性的抗逆转录病毒治疗(HAART)能有效地诱导CD4+ T细胞数量增加，而使CMV感染降低，其结果是在人体免疫缺陷病毒-1(HIV-1)型病毒感染的患者中，CMV耐药株有所下降［3］，在移植受者中进行CMV耐药株的估计比较困难。Seattle报道：1996～1997年的240例患者，其中有108例肝脏移植、101例肾移植、31例胰肾联合移植，所有患者均接受更昔洛韦预防治疗，在5例患者中出现CMV耐药株。Cleveland报道：1990～2001年的228例肺移植、790例心脏移植、495例肝脏移植和832例肾移植，其耐药性的发生率为11/2345。Chicago的研究：1994～2001年的99例肺移植、38例心脏移植、18例肝移植和45例肾移植，这些患者均接受更昔洛韦预防治疗，19例出现耐药株［4］。Pavia的研究［5］：包括721例心脏移植、210例肺移植患者，1985～1990年，患者只是在出现CMV相关的临床症状后才进行治疗，1990年后，所有患者均预先进行检测，并进行先占性治疗，结果只有1例出现CMV耐药株。这些资料表明，实体器官移植中，CMV耐药性变化很大，从0.1%～2.0%至10%不等(见表1)；先占性治疗可能会降低耐药性的产生。kruger等［6］研究发现，耐药CMV感染在肺移植患者中占5.2%，他们认为这个数值可能由于预后性研究而有所低估。2004年有人报道耐药性CMV感染占肺移植患者的10％［7］。新型免疫抑制的应用能更好地控制移植器官的排斥反应，但同时也增加了CMV再激活的机会，而可能使实体器官移植中CMV耐药株的数量增多。表1 近年大型队列研究中CMV耐药株的发生率(略)注：D/R：供者/受者关系。
2 相关的临床、病毒学特点
在前高活性抗逆转录病毒时代，CMV是AIDS患者中的主要机会性病原体。CMV感染最常见于血液中CD4+ T细胞数量低于100/mm3时，其发病率、病死率均增加；外周血中CMV的出现是播散性CMV感染的标志［8］，其临床症状的严重程度与血液中CMV病毒的负荷量有相关性。当时一般是在出现CMV相关症状后才开始应用药物进行治疗，只能在一段有限的时间内抑制CMV水平，在未经治疗的情况下，一定会出现CMV感染的发生，当时经常在抗CMV治疗数周或数月后出现耐药株。在实质器官移植的研究中，应用了预防性治疗和先占性治疗方案，有超过94%的耐药株出现在D+/R-(供者CMV血清学阳性/受者阴性)的器官移植中，而且，肺和胰腺移植的受者出现耐药株变异的可能性较大。目前普遍认为，CMV耐药的危险因素有接受CMV血清阳性供者的器官(D+/R-)、长期口服更昔洛韦(>3个月)、高病毒含量 (>106拷贝/L)、高效免疫抑制剂应用等［９］。CMV耐药多发生在D+/R-的患者中。有研究表明，肺移植1年后，D+/R-的患者(27％)比单纯D-/R+(3％)患者出现CMV耐药更为普遍［7］。对于D+/R-的患者，移植后12个月出现耐药的概率：肝移植为0，肾移植为1％，肾/胰腺移植为21％，而肺移植为40％。所以，对于D+/R-患者应该进行有效的预防性或先占性治疗，即使对血液中CMV病毒负荷较轻的患者，也应该将病毒清除，以防止耐药病毒株的出现。临床上发现肺移植患者更易出现CMV感染或疾病，而且机体的高病毒含量似乎更易使更昔洛韦治疗中出现耐药的CMV，故推测肺移植患者耐药性高发的原因与其高水平的病毒含量有关；同时还发现在肺移植患者中，耐药CMV的出现较其他实体器官移植中出现的时间早(平均4.4个月∶10个月)，以更昔洛韦进行治疗的时间短(平均100d∶196d)［10］。
3 耐药性的靶点和机制
CMV DNA多聚酶是当前治疗CMV感染的抗病毒药物的特异性靶点［11］；此类药物针对的都是病毒编码DNA多聚酶的复制功能，临床常用的抗CMV感染药物主要有更昔洛韦、西多福韦和膦甲酸钠，其中最常用的是更昔洛韦；膦甲酸钠常用于更昔洛韦无效的情况下。西多福韦主要用于治疗AIDS患者的视网膜炎，阿昔洛韦及其前体valacyclovir用于预防疱疹病毒。耐药性的突变通常出现于长期使用抗病毒药物的情况下，其原因认为很可能是因为病毒DNA多聚酶的校正读码功能极大地降低核苷酸的错参率。耐更昔洛韦病毒株最常发生的突变位点是磷酸转移酶基因(UL97)［12］，在该处出现的突变抑制了药物的合成代谢，降低了更昔洛韦的磷酸化作用，因而抑制其转化成有活性的细胞内三磷酸盐复合物。编码 DNA多聚酶的基因为UL54序列，同UL97序列不同，UL54基因发生突变后可能导致对更昔洛韦、膦甲酸钠都产生耐药。UL54序列较为复杂，包括I～VI、δ-region C和A等几部分疱疹病毒科的高度保守区和间隔区。目前发现和证实的UL54耐药相关突变都位于高度保守区，主要有N408D、F412C、K513E、D588E等。通过重组病毒的研究已得到结论，突变若位于Ⅳ区和δ-region C (UL54序列N末端)及V区(UL54序列C末端)则导致对更昔洛韦和西多福韦耐药，若位于Ⅱ区和Ⅳ区(UL54中间)则对膦甲酸钠耐药。对西多福韦和膦甲酸钠耐药性的突变只出现于UL54基因上［13］。目前，对UL54基因耐药性突变的研究已取得了很大的进展，其中最主要的是对点突变的研究，其耐药性突变可发生于密码子300至1000之间的一段巨大的区域中。Mchrdad等［14］发现在UL54的保守区T419M、Q578H和L773V中有3个新的突变，导致对膦甲酸钠的耐受，而不产生对更昔洛韦的耐受性。总之，对更昔洛韦的耐药性来自于UL97、UL54或两者的突变，而对西多福韦和膦甲酸钠耐药性的突变只见于UL54。进一步分析发现，UL54中对更昔洛韦耐药性的突变能对西多福韦产生交叉耐药性，这种耐药性的主要原因是长期使用更昔洛韦造成的。
4 耐药性的检测
对耐药CMV病毒株耐药性的检测分为表型和基因型两种方法。表型的检测方法是检测细胞培养基中的病毒复制，根据药物的浓度和病毒的生长状况来IC50，进而把病毒分为敏感型和耐药型。该方法的周期很长，因为病毒生长慢，并需要活的病毒。CMV耐药性检测的“金标准”是空斑降解检测方法［15］，该方法是在药物存在的情况下，通过测定受感染的斑块而进行的，实验步骤包括病毒的分离培养、传代培养和扩增、量的滴定、耐药浓度的测定，完成整个实验需要1个月以上的时间，而且在传代培养中可能出现另外的耐药株，因而限制了该方法的广泛应用。目前已开发出采用流式细胞仪、放射探针、酶联免疫吸附试验(ELISA)等检测方法，以缩短检测时间，这些方法都需要活的病毒株，并在分析过程中，还应有标准的耐药株和敏感株作对照，也限制了临床应用［16］。基因型检测是建立在CMV基因组中耐药性突变的基础上，耐更昔洛韦的CMV株主要是UL97基因的突变，这些突变集中于密码子460、520和590-607，因而可以用PCR加酶切的方法来检测。密码子460和594的突变导致内切酶位点的消失，而密码子520和595的突变导致内切酶位点的增加，通过电泳生成不同的内切酶图谱，只要突变的病毒株达到所有病毒株的10％，即可检测得到。这种限制性酶内切方法最大的优点是操作简便、快捷，在2d内即可得到结果，并且可适用于多种临床标本(血浆、脑脊液等)，缺点是不能发现不导致限制性内切酶图发生改变的突变，例如少数突变只发生于UL54序列，不存在于UL97序列。所以限制性内切酶图阳性的标本可以肯定是对更昔洛韦耐药，而对于阴性的标本不能完全肯定绝对不耐药，有时需要做进一步的测序工作。目前，PCR加限制酶切的方法不仅限于检测UL97的突变， 也可以用来检测UL54序列中的L501F和A809V基因。由于基因测序技术已取得了很大的进展，用PCR加酶切或DNA核苷酸测序以检测病毒株发生的基因突变，是当前的最佳检测手段。总之，对CMV耐药性的研究表明，长期使用抗病毒药物导致了耐药株的产生，其交叉耐药性和与药物相关的毒性作用限制了药物的效果，因而当前急需研究新的作用机制，研制新的抗CMV药物。
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