阿伐他汀对去势大鼠骨折愈合的影响
【摘要】 目的 研究阿伐他汀局部注射对去势大鼠骨折愈合的影响。方法 2月龄雌性SD大鼠采用去势方法模拟人绝经后骨质疏松症，进一步建立胫骨骨折髓内钉内固定模型，实验组于骨折端皮下注射阿伐他汀(10mg·kg-1·d-1×5d)，对照组注射无阿伐他汀的溶剂。骨折后1、2、4周取标本，通过X线片、生物力学、组织病以及组织形态计量学等评价两组骨折愈合质量。 结果 与对照组相比，实验组骨痂横截面积在骨折后1周、2周分别增加24.3% (p<0.05) 和33.2% (p<0.05)；骨痂最大载荷在骨折后2周、4周分别增加43.1% (p<0.05) 和69.8% (p<0.05)；组织学显示实验组新生编织骨较对照组多且排列致密。结论 局部应用阿伐他汀可促进去势大鼠骨折愈合。
【关键词】 阿伐他汀 大鼠 骨质疏松 骨折愈合
【Abstract】 Objective To explore the influence of Atorvastatin on fracture union of emasculated rats. Methods Postmenopausal osteoporosis was simulated on emasculated female rats of 2 months old , further model of internal fixation with bone nail in treating tibia fracture was developed .In treating group , Atorvastatin was subcutaneous injected (10mg·kg-1·day-1×5day) locally at fracture site , in control group ,solution without Atorvastatin was used as control .Spacemen were collected 1、2、4 weeks after fracture , the quality of fracture union was evaluated by X-ray 、vitodynamics、histopathology and morphometry. Results The section area of osteotylus in the treating group increased 24.3% (p<0.05) and 33.2% (p<0.05) in one and two weeks after fracture; maximal load of osteotylus increased 43.1% (p<0.05) and 69.8% (p<0.05) two and four weeks after fracture ; histological finding showed neogenesis woven bones were more and compactly arranged in treating group than those in control one . Conclusions Local Atorvastatin injection helps the fracture union in fracture union of emasculated rats.
【Key words】 Atorvastatin Rat Osteoporosis fracture union
目前骨质疏松的大多数药物，如雌激素、双膦酸盐类化合物、降钙素、选择性雌激素受体调节剂等，主要是通过抑制骨吸收来防止骨量的丢失，而刺激新骨形成的药物为数很少。近年来的研究表明，目前广泛应用于降脂药的HMG-CoA 还原酶抑制剂 (即他汀类药物)，能刺激体外培养的成骨细胞增值，促进新生小鼠颅骨及皮质骨的新骨形成［１］。但目前绝大多数的研究针对非骨折骨，而且他汀类药物均为超高剂量的口服用药［２］。口服他汀类药物绝大多数分布在肝脏中，在骨折端的浓度极低，并且超大剂量的口服用药会增加肝肾功能的损害［3］。本实验的目的为研究局部应用阿伐他汀能否促进骨折愈合。
1 材料与方法
1.1 动物 2月龄雌性SD大鼠，初始体重178～201g，动物房要求23°C恒温，昼夜12h，自由进食自来水。 随机分成去势组(n=120)和假手术组(n=10)。5%盐酸氯氨酮(2ml·kg-1)腹腔内注射麻醉后，取双侧背外侧切口，去势组结扎卵巢营养血管并切除双侧卵巢，假手术组仅暴露双侧卵巢而不作结扎和切除，术后均喂养于原环境，给等量的食物。术后12周，各取10只大鼠，全麻后用双能X线吸收仪及其配套的小动物模式进行右胫骨骨矿物含量(BMD)测定。
1.2 骨折内固定模型 所有去势大鼠平均分成空白溶剂(Vehicle)组和阿伐他汀(AVS)组，进一步建立骨折内固定模型。全麻后，在右胫骨近1/3处用骨刀平整切断胫骨(尽量不折断同侧腓骨)，为稳定骨折端，用直径0.5mm的消毒牙科钢丝经胫骨结节插入行髓内固定，缝合切口，术后抗炎3d(青霉素80万U，肌注，2次/d)。
1.3 给药方法 AVS组骨折端皮下注射阿伐他汀 5 mg·kg-1，Vehicle组骨折端皮下注射空白溶剂 30～50μl，手术当天注射1次，以后连续5d，2次/d。注射方法参照［１］，注射针头直径0.4mm，注射器最大刻度250μl，最小刻度10μl。注射应避开骨痂。
1.4 骨折愈合评价 骨折后1、2、4周处死大鼠取标本进行骨折愈合质量评价。放射学:处死前1d，大鼠在全麻下用钼靶乳腺X线机(22kV, 250mAS)摄右胫骨前后位片，a为无桥接骨痂，b为单侧桥接骨痂，c为完全桥接骨痂。生物力学测定：每组取10只大鼠测定，取其双侧胫骨，成对包裹于生理盐水纱布中，保存于-20°C冰箱内，测定前1d标本于室温下解冻，用游标卡尺(敏感度0.02 mm)测量骨痂前后径和横径；取出髓内钉，在Zwick-Z010测试机上行三点弯试验，测试跨距为30mm，加载速度为2 mm·min-1，测试过程中保持标本在同一方位并一直保持湿润，记录载荷-位移曲线。组织学分析：每组取5只大鼠，连同骨痂周围骨膜取下右侧胫骨，抽出髓内钉，切取包含骨痂的骨段，用4%多聚甲醛(pH 7.4)室温下固定24h，EDTA液(0.5mol/L, pH 7.4)脱钙3～5周，每5～7d更换新鲜脱钙液至能被细针轻松插入，PBS液冲洗，酒精梯度脱水，石蜡包埋，纵向5μm切片，固定于经0.01% 多聚赖氨酸表面处理的载玻片上，60°C烘干过夜，HE染色，光镜(Olympus BH-2)下观察。
1.5 统计学处理 数据以(x±s）表示。用SPSS 11.5软件，行组间单因素方差分析或χ２检验。
2 结果
大鼠去势后12周，胫骨BMD假手术组(0.241±0.010)g/cm2，去势组(0.219±0.005)g/cm2，差异有非常显著性(p<0.01)。骨折后大鼠Vehicle组4只、AVS组3只死亡，无骨折端感染发生，两组大鼠体重差异亦无显著性。
2.1 放射学 X线片上骨折均显示愈合。两组桥接骨痂在术后均随着时间延长而增加，骨折后1周两组间差异无显著性，骨折后2周、4周，AVS组较Vehicle组有更多的骨痂，但差异无显著性(2周时, P=0.077；4周时, P=0.062)。骨痂面积：骨折后1周，AVS组(23.42±3.42)mm2，较Vehicle组的(18.84±4.02)mm2增加24.3% (P<0.05)；骨折后2周AVS组(31.63±3.25)mm2，较Vehicle组的(23.75±3.19)mm2增加33%(P<0.05)。
2.2 生物力学 骨折后1周，两组实际最大负荷和相对最大负荷差异均无显著性。 骨折后2周，AVS组实际最大载荷为(25.37±6.67)N， 较Vehicle组的 (17.73±6.32)N增加43.1%(P<0.05)；相对最大载荷AVS组（49.48±10.60）N，较Vehicle组的(33.62±13.13)N增加47.2% (Ｐ<0.05)。骨折后4周，AVS组实际最大载荷(49.32±9.59)N，较Vehicle组的(29.05±5.51)N增加69.8%(Ｐ<0.05)；相对最大载荷（89.45±17.93）N，较Vehicle组的(55.47±16.25)N增加61.3%(Ｐ<0.05)。
2.4 骨痂组织学 HE染色显示，骨折后1周AVS组有软骨骨痂形成，而Vehicle组不明显；AVS组骨膜下成骨较Vehicle组多。骨折后2周、4周，两组均显示有较多的骨痂，中央区的软骨内成骨和骨折端的骨膜下成骨，但与Vehicle组相比，AVS组骨小梁排列相对较规则且致密。
3 讨论
自Mundy首次报道以来，多数研究认为他汀类药物具有增加骨量和降低骨折危险性的作用［4，5］，但也有相反意见［6，7］，另有认为他汀类药物对骨骼作用存在剂量依赖性关系。动物实验表明，高剂量的辛伐他汀(20 mg·kg-1·d-1)可增加骨形成和骨吸收，而低剂量的辛伐他汀(1 mg·kg-1·d-1)则降低骨形成和骨吸收［8］。对于绝经后妇女，Tikiz等［6］发现20 mg·d辛伐他汀1年后，BMD无明显变化，而Montagnani等［4］报告40 mg·d-1辛伐他汀治疗1年后，腰椎、股骨颈和全股骨BMD分别增加2.8%、1.0%和0.8%。同样经40 mg/d辛伐他汀治疗1年，Rejnmark等［7］未发现髋部和脊柱BMD有明显变化。引起上述差异的原因非常复杂，包括观察对象的可比性、研究暴露时间、研究对象的同质性等问题。另外，有两点必须引起注意，首先，他汀类药物口服后，绝大部分沉积在肝脏，仅5%分布在血液中［3］，在骨骼中的浓度则更低；其次，在正常骨骼中，由于骨重建单位相对较少，他汀类药物的骨骼作用受到一定的限制，而在骨折愈合过程中，骨重建单位增加，骨骼对药物反应的表现将被放大。本实验中，阿伐他汀通过注射器局部注射于骨折端皮下，这样可通过局部扩散作用增加骨折端的药物浓度，远比口服给药浓度高。
根据以往的安全性研究数据［9］，作者选择了本实验的药物剂量，从药物动力学讲，由于大鼠的代谢过程是人的10倍左右，10 mg·kg-1·d-1的剂量相当于人的70 mg·d-1。尽管该剂量以高于临床常规剂量(20-40 mg·d-1)，但已远低于以往的动物实验中的剂量(120 mg·kg-1·d-1)［２］。本实验中，相对低剂量的阿伐他汀局部注射于骨折端皮下，术后2周即可见骨痂横截面积和骨折最大载荷的明显增加，且未发现严重的副作用，与Mundy等［１］的研究结果一致。
本研究显示阿伐他汀骨折端局部皮下注射可促进去势大鼠骨折愈合，但也存在一些不足。第一，药物剂量仍大于临床常规用量，因此尚不能推断对人体也一样有效，但尽管如此，仍提示他汀类药物可能成为促进骨折愈合的药物之一；第二，直接皮下注射为一种侵入性操作，有导致感染等风险。如果能通过恰当的载体，如纤维凝胶、内植入物表面等，局部应用他汀类药物推断可能会成为促进骨质疏松症病人骨折愈合的一种新的有效手段。
【】
1 Mundy G, Garrett R, Harris S, et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science, 1999, 286(5446):1946～1949.
2 Ohno T, Shigetomi M, Ihara K, et al. Skeletal reconstruction by vascularized allogenic bone transplantation: effects of statin in rats. Transplantation, 2003,76(5):869～871.
3 Blum CB. Comparison of properties of four inhibitors of 3-hdroxy-3methyglutary-coenzyme A reductase. Am J Cardiol, 1994, 73(14):3D～11D.
4 Montagnani A, Gonnelli S, Cepollaro C, et al. Effect of simvastatin treatment on bone mineral density and bone turnover in hypercholesterolemic postmenopausal women: a 1-year longitudinal study. Bone, 2003,32(4):427～433.
5 Schoofs MW, Sturkenboom MC, Klift M, et al. HMG-CoA reductase inhibitors and the risk of vertebral fracture. J Bone Miner Res,2004,19(9):1525～1530.
6 Tikiz C, Tikiz H, Taneli F, et al. Effects of simvastatin on bone mineral density and remodeling parameters in postmenopausal osteopenic subjects: 1-year follow-up study. Clin Rheumatol, 2005,24(5): 447～452.
7 Rejnmark L, Buus NH, Vestergaard P, et al. Effects of simvastatin on bone turnover and BMD: a 1-year randomized controlled trial in postmenopausal osteopenic women. J Bone Miner Res, 2004,19(5):737～744.
8 Maritz FJ, Conradie MM, Hulley PA, et al. Effect of statins on bone mineral density and bone histomorphometry in rodents. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2001,21(10):1636～1641.
9 Gerson RJ, MacDonald JS, Alberts AW, et al. Animal safety and toxicology of simvastatin and related hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors. Am J Med, 1989,87(4A):28S～38S.
10 Skoglund B, Forslund C, Aspenberg P. Simvastatin improves fracture healing in mice. J Bone Miner Res, 2002,17(11):2004～2008.
