阿托伐他汀对鼠动脉粥样硬化基质金属蛋白酶和C-反应蛋白的影响

                作者：章义利 戴凌燕 周秀云 应斌宇 张怀勤    

【摘要】  　　目的 探讨阿托伐他汀对动脉粥样硬化鼠主动脉基质金属蛋白酶2、9（MMPs）及血中C-反应蛋白（CRP）的影响。方法 将雌性SD大鼠50只分为对照组(ｎ=10,正常饮食)、模型组(ｎ=20,维生素D3+高脂饲料+正常饮食)、阿托伐他汀组(ｎ=20,维生素D3+高脂饲料+阿托伐他汀)。4个月后处死，取主动脉起始部行光镜和电镜观察，其余部分用于免疫印迹法检测MMPs的表达水平。于实验前及实验结束时对实验鼠行空腹股动脉取血,分离血清,检测血清胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平以及CRP的水平。 结果 实验前各组大鼠血脂学及CRP水平差异无显著性，实验结束时模型组TC、TG、LDL显著高于对照组（P<0.01）, 阿托伐他汀组低于模型组(高于对照组)；MMP-2、MMP-9相对值模型组8618±549和9054±350，明显高于对照组的表达(对照组5314±163和6178±254)，而阿托伐他汀组3397±453和6805±368，低于模型组(P<0.01)；CRP模型组（18.64±0.94)mg/L，显著高于对照组的（9.21±0.2）mg/L，而阿托伐他汀组(12.52±0.65)mg/L，显著低于模型组（P<0.01）。对照组主动脉病改变比阿托伐他组显著，对照组改变不明显。 结论 阿托伐他汀能抑制基质金属蛋白酶和CRP的表达，在稳定粥样斑块过程中可能起重要作用。

【关键词】  动脉粥样硬化 阿托伐他汀 基质金属蛋白酶 C-反应蛋白

　　【Abstract】  Objective  To investigate the effect of atorvastatin on expression of C-reactive protein (CRP) and matrix metalloproteinase-2,9 in experimental atherosclerosis of rats. Methods  Fifty female Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal diet group (n=10,control group); vitamin D3 injection and high cholesterol diet group (n=40). After 8 weeks, vitamin D3 injection and high cholesterol diet rats were randomly switched to received atorvastatin (5mg.kg-1.day-1) (n=20,atorvastatin group) or normal diet (n=20, model group).Another eight weeks later, all the rats were killed and some of their aortas were observed by light and electron microscope, the left aortas were removed for western blot analysis to detect MMP-2,-9 . At the begin and end of experiment, serum was collected for serum lipid and CRP determining. Results  There were no significant changes in serum lipids and CRP at the beginning of experiment between the groups ,But after two months, Cholesterol, low density lipoprotein(LDL), triglyceride(TG) of atorvastatin group were significantly lower than those of model group(P<0.01) but higher than control group(P<0.01). The pathologic changes of atorvastatin group were less serious than those of model group, there was not any pathological changes in control group. MMP-2,-9 were significantly higher in the model group(8618±549， 9054±350,respectively) than those in the control group(5314±163 ，6178±254) (all P<0.01 ), But compared with the model group, MMP-2,-9 levels were markedly lower in the atorvastain group（3397±453， 6805±368）(all P<0.01). The levels of CRP in the model group(18.64±0.94 mg/L) were higher than those in the control group (9.21±0.21 mg/L) (P<0.01). CRP levels also differed significantly between control group and atorvastain group(12.52±0.65mg/L)(P<0.05). Conclusions  Atorvastatin inhibitis MMPs and CRP 's express ,which may play an important role in plaque stabilization.

　　【Key words】  Atheroslerosis  Atorvastatin  Matrix metalloproteinases  C-reactive protein
   
　　他汀类药物除具有良好的调脂作用外，还具有改善内皮功能失调、抑制炎症反应、抗血栓形成、稳定斑块并能抑制平滑肌细胞增殖、迁移和不良的血管重塑等作用［１，2］，这些作用能降低心脑血管疾病的发生率和死亡率，在心脑血管疾病的一级和二级预防中具有重要的作用和意义。本研究旨在探讨阿托伐他汀对动脉粥样硬化鼠主动脉基质金属蛋白酶2、9及血中C-反应蛋白(CRP)的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物与试剂  雌性SD大鼠50只，清洁级，日龄30～45d，体重150～200g；维生素D3购自上海第九制药厂，甲巯咪唑购自上海中西药业公司，胆酸钠购自温州生物化学制药厂，胆固醇购自北京化学试剂公司，猪油为市售食用猪油；阿托伐他汀由辉瑞公司惠赠，MMPs免疫印迹试剂盒购自武汉博士德生物公司,硝酸纤维素膜 Sigma公司提供。

　　1.2  大鼠动脉粥样硬化(AS)模型的建立［3］  将大鼠随机分为对照组(C组，n=10,)、模型组(M组，ｎ=20)、阿托伐他汀组(A组，ｎ=20)。对照组大鼠喂普通饲料, 模型组和阿托伐他汀组大鼠先腹腔注射维生素D3（70万IU/kg，分4次，1次/2d），然后喂食高脂饲料(1%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.1%甲巯咪唑、5%猪油，93.4％为基础饲料)。2个月后，阿托伐他汀组大鼠强制性喂食含阿托伐他汀（5mg/kg）的颗粒饲料(5g/只)后，再补充15g普通颗粒饲料；模型组大鼠喂普通饲料。所有大鼠均分笼按清洁级动物饲养,饮用洁净水，整个试验周期为4个月。

　　1.3  标本的收集与处理  各组动物分别于实验前及实验结束时行空腹股动脉取血,分离血清,用以血脂学检验，并于实验结束时将其处死, 立即取主动脉(从主动脉弓至腹主动脉分叉处)，截取主动脉弓放入4%多聚甲醛固定液中固定，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜观察其形态；在主动脉起始处切取主动脉组织块，用2.5%戊二醛中固定以备电镜观察；剩余的主动脉置于液氮中然后储存于－80℃冰箱,用于免疫印迹。在整个试验中，共有15只大鼠死亡或中途用于观察动脉粥样硬化形成情况。

　　1.4  主动脉形态学观察  4%多聚甲醛固定液中固定的主动脉脱水，石蜡包埋，切成约4μm厚切片，HE染色，光镜下进行形态学观察；将固定在2.5%戊二醛中的主动脉切成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，用1%锇酸固定6h，EPON812包埋，LKB-V型超薄切片机切片，常规染色，H-600型透射观察主动脉内膜、中膜的超微结构改变。

　　1.5   MMPs免疫组化  石蜡包埋的主动脉组织切成4μm厚切片，采用S－P法,用PBS代替一抗作阴性对照,已知阳性切片作阳性对照。

　　1.6  MMPs免疫印迹分析  称取60～100mg低温保存的主动脉组织,放入洗净的研钵中,小心加入一定量的液氮后,快速研磨成粉状,再按1:10(mg /μL)加入匀浆缓冲液［50mmol/L-Cl(pH8.0),150mmol/L NaCl,0.1%SDS,0.5%去氧胆酸钠］继续研磨成匀糊状。Bradford法测定蛋白量。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电转移,稀释MMP－2、9的一抗1：300,4℃下与硝酸纤维素膜结合过夜。TBS液洗涤硝酸纤维素膜10min×3次。1∶400稀释二抗,37℃下与膜结合30min。TBS液洗涤硝酸纤维素膜10min×3次,1:50稀释链酶亲和素标记生物素抗体,37℃下与膜结合31min。TBS液洗涤硝酸纤维素膜10min×3次,然后显色,ImageMasterVDS凝胶成像扫描分析仪扫描存挡,读取各条带蛋白质的相对含量。

　　1.7  血脂学及CRP检验  用日立7600生化全自动分析仪检测TC、TG、HDL水平。LDL通过(TC-HDL-TG)/2.2来获得。CRP采用ELISA法检测。

　　1.8  统计学处理  采用SPSS 11.0 软件。数据以(x±s) 表示，采用单因素方差分析,方差齐者两两比较采用LSD法,方差不齐者进行Games-Howell检验。

　　2  结果

　　2.1  血脂水平的变化  见表1。试验前各组血脂水平差异无显著性。试验后模型组TC、TG、LDL均显著高于对照组（P<0.01）,HDL低于对照组（P<0.05）；阿托伐他汀组TC、TG、LDL显著低于模型组（P<0.01），而高于正常对照组（P<0.01）,HDL与模型组相比差异无显著性(P＞0.05)，但有升高趋势。

　　表1  试验前后各组血脂水平（略）

　　注：与对照组相比，?p＜0.0５；??p<0.0１；与模型组相比，△p＜0.01

　　2.2  MMPs、CRP表达的变化  MMP-2、MMP-9 表达，模型组显著高于对照组（P<0.01），而阿托伐他汀组显著低于模型组(P<0.01)。CRP表达实验前各组差异无显著性，实验结束时模型组显著高于对照组（P<0.01），而阿托伐他汀组显著低于模型组（P<0.01）。详见表2

　　表2  各组大鼠CRP和MMPs表达的变化（略）

　　注：与照组相比，?p＜0.01； 与模型组相比△p＜0.01

　　2.3  形态学的变化  (1)光镜下：模型组可见主动脉内膜增厚，中膜钙化，且不规则增厚，有泡沫细胞形成，平滑肌纤维排列显著紊乱；阿托伐他汀组主动脉中膜层较对照组显著增厚，但较模型组略变薄，平滑肌纤维排列紊乱，中膜层多灶性钙化；对照组主动脉平滑肌排列整齐规则，管腔内皮光滑，无增生。(2)电镜下：模型组胶原纤维明显增多、排列紊乱、局灶性纤维溶解变性，局部有脂质样颗粒沉积在细胞间隙中，平滑肌细胞核固缩、核染色变深、部分可见坏死的平滑肌细胞、线粒体空泡化、弹力板断裂、染色变淡、呈断续状排列，内皮细胞大部分脱落、局灶有血栓形成（大量红细胞）、可见有泡沫细胞；对照组内皮完整，平滑肌纤维正常、排列紧密，胶原纤维排列规则、无增生；阿托伐他汀组内皮细胞脱落减少，平滑肌细胞形态基本正常、排列稍紊乱、线粒体基本正常、少量轻度水肿空泡化，胶原纤维结构清晰、增生较多、溶解现象少见，内弹力板少量断裂，未见血栓及脂质颗粒形成（图1～4）。(3)MMPs免疫组化：MMPs主要集中在坏死钙化区以及平滑肌增厚区。

　　图1  正常的平滑肌细胞电镜图片(×20000)；（略）

　　图2  模型组胶原纤维显著增多，局部有溶解，平滑肌细胞核固缩(×20000)；（略）

　　图3  模型组泡沫细胞质内可见大小不等的脂质颗粒(×20000)；（略）

　　图4  阿托伐他汀组平滑肌细胞形态基本正常，排列稍紊乱，胶原纤维结构清晰(×20000)（略）

　　3  讨论
   
　　冠状动脉斑块破裂、血小板聚集、血栓形成是冠状动脉粥样硬化导致急性冠脉综合征（ACS）的关键, 大量证据表明，炎症是ACS的重要促发事件。CRP是 AS斑块的炎症标记物,与斑块的进展密切相关，临床上已作为AS 斑块破裂的血清学标志物。尸检发现,ACS 中斑块破裂常发生于斑块的肩部区,该区炎症最明显,CRP 沉积较多，表明CRP与斑块稳定性密切相关［4］。也有研究证实CRP直接加速了AS的进展［5］。这些事实表明CRP不仅是AS的炎症标志物，同时也通过某些机制参与了AS的形成和发展。因此，抑制CRP水平具有重要意义。本研究模型组CRP水平较正常对照组显著提高，而阿托伐他汀组则显著降低，表明阿托伐他汀能抑制CRP表达，从而达到抑制AS的进展和不稳定。抑制炎症反应的确切机制目前尚不清楚，但已经证实这种作用与降脂作用无关［6］，可能与其能减少巨噬细胞数量、抑制组织因子活性及表达以及抑制前炎症介质的表达有关［7］。
   
　　MMPs 是一组可消化细胞外基质的重要酶类,它通过降解纤维帽成分,破坏其结构，加速斑块破裂，导致ACS 发生, 是造成AS斑块不稳定的重要原因［8］。抑制MMPs的表达对于稳定斑块，防治ACS的发生具有重要意义。本实验结果表明，模型组MMPs比正常对照组显著提高，且坏死钙化和平滑肌增厚区免疫组化显示MMPs聚集，提示AS时存在着斑块不稳定和细胞外基质降解增加，而阿托伐他汀能显著抑制MMPs的表达，显著改善大鼠主动脉形态学变化，这可能是其稳定粥样斑块、降低冠心病人发病率和病死率的一个重要原因。

【】
  　　1 Rosenson RS , Tangney CC. Antiatherothrombotic properties of statin : implications for cardiovascular event reduction. 　JAMA , 1998 , 279 (20) : 1643～1650.

　　2 Rauch U , Osende J I , Chesebro JH. 　Statins and cardiovascular diseases : the mutiple effects of lipid-lowing therapy by statins . 　Atherosclerosis , 2000 ,153 1) : 181～189.

　　3 吴开云，高摄渊，袁融，等.维生素D诱发大鼠动脉粥样硬化的实验研究. 解剖学报，1996，27（2）：133～135.

　　4 Torzewsi J , Torzewski M ,Bowyer D F , et a1. C-reactive Protein frequently colocalizes with the terminal complement complex in the intima of early atherosclerotic lesions of human coronary arteries.Arterioacler Thromb Vasc Biol , 1998 , 18 : 1386～1392.

　　5 Paul A, Ko KW, Li L, et al. C-reactive protein accelerates the progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation, 2004, 109:647～655.

　　6 Nissen SE, Tuzcu EM, Schoenhagen P, et al. Reversal of a therosclerosis with aggressive Lipid Lowering (REVERSAL ) Investigators. Statin therapy, LDL cholesterol, C-reactive protein, and coronary artery disease . N Engl J Med,2005, 352 (1) : 29～38.

　　8 Hernandez-Presa MA, Marti-Ventura JL, Ortego M, et al. Atorvastatin reduces the expression of cyclooxygenase-2 in a rabbit model of atherosclerosis and in cultured vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis ,2002,160:49～58.

　　9 Morishige K, Shimo Kawa H , Matsumoto Y, et al. Overexpression of matrixmetallo-proteinase－9 promotes intravascular thrombus formation in porcine coronary arteries in vivo . Cardiovasc Res , 2003 ,57 :572～585.