阿司匹林对大鼠脊髓损伤细胞凋亡的保护作用

             作者：王景，夏亚一，李延宏，潘文杰，赵斌

【摘要】  目的 观察阿司匹林对大鼠慢性压迫性脊髓损伤后神经细胞凋亡及神经功能恢复的影响。方法 选择65只体重为220～250 g的Wistar大鼠(雌雄不限)，于T10部位置入后路渐进式压迫装置，制作成慢性压迫性脊髓损伤模型。随机分为阿司匹林组(A组，30只)、生理盐水对照组(B组，30只)和假手术组(C组，5只)。应用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记技术，分别于慢性压迫性脊髓损伤后1、3、7、14、28 d做行为学评价，并取材对脊髓损伤区进行细胞凋亡检测。结果 A、B组均发现细胞凋亡，A组与B组细胞凋亡率相比差异有显著性(P＜0.05)，A组与B组行为学评价相比差异有显著性(P＜0.05)，神经细胞凋亡情况与运动功能改变具有相关性。结论 阿司匹林对慢性脊髓压迫损伤后所导致的神经细胞凋亡产生抑制作用。

【关键词】  阿司匹林；慢性压迫；脊髓损伤；神经保护；细胞凋亡

    Neuroprotection Effect of Aspirin on Neuron Apoptosis Following Chronic Spinal Cord Compressive Injury in Rats

     Abstract：Objective  This study evaluated the neuroprotection effect of aspirin on neuron apoptosis following chronic spinal cord compressive injury in rats.Methods  The chronic spinal cord compression model made of 65 Wistar mice(Weight 220～250 g) were assigned into the following 4 groups randomly.30 mice into the aspirin therapy group (Group A)，30 mice into the normal sodium (NS) control group (Group B) and 5 mice into the sham operation group (Group C).Applied the locomotor′s function scale and the TUNEL immunohistochemistry technique labeled of the spinal cord injuring profiles on 1st、3rd、7th、14th、28th days of post operation respectively.Result  Group A reduced the neuron apoptosis，the Apoptosis Index (AI) and the results of locomotor′s function scale compare with Group B，those that has significant difference (P＜0.05).There is a high relativity between the neuron apoptosis and locomotor′s function.Conclusion  These results suggest that the protective effects of aspirin against neuron apoptosis following chronic spinal cord compressive injury.

    Key words：aspirin；chronic compression；spinal cord injury；neural protection；apoptosis

    慢性脊髓压迫性疾病由于椎管内存在占位性病变，脊髓受到持续、渐进性的压迫，神经、运动系统损害程度逐渐加重。研究表明，其主要病理机制在于脊髓受损神经细胞凋亡，引起一系列继发性病理损伤和临床症状。本实验研究采用后路渐进慢性压迫性脊髓损伤的动物模型，给予阿司匹林干预，于慢性压迫性脊髓损伤后不同时间点采用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记法(terminal deoxynucheotide transferase?mediated deoxyuridine?biotin nick end labeling，TUNEL)，观察阿司匹林对慢性压迫性脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响。

    1  材料和方法

    1.1  慢性压迫性脊髓损伤动物模型的制作  65只体重220～250 g的健康Wistar大鼠(雌雄不限，兰州军区兰州总实验动物中心提供)，2％的戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔内注射麻醉。常规消毒铺巾，取后正中切口，切除T10棘突，以平头钻行椎板钻孔，暴露硬膜。用直径3 mm、螺距0.5 mm、经高压蒸汽灭菌的不锈钢平头螺钉旋入T10椎板，螺钉头端呈水平面。初次旋入时螺钉头面仅与硬脊膜接触，以旋入过程中大鼠后肢不出现跳动，挤捏大鼠尾根部可引出反应，且植入螺钉牢固为度，证明未造成脊髓损伤。以后每隔5 d显露螺钉，将螺钉旋入1/2圈约0.25 mm，造成大鼠脊髓渐进性压迫性损伤，于造模后第1、3、7、14、28 d取材观察。

    1.2  试剂配置  阿司匹林0.18 g加入50 mL双次蒸馏水，配成浓度为20 mmol/L的悬浮液，现用现配。

    1.3  动物分组  将上述65只大鼠随机分组：慢性脊髓压迫阿司匹林治疗组(A组，30只)，慢性脊髓压迫生理盐水对照组(B组，30只)，假手术组(C组，5只，仅行椎板钻孔术)。模型制作完成10 min后，A组腹腔注射阿司匹林(30 mg/kg)，此后每隔5 d同途径同剂量再次注射；B组腹腔注射等量的生理盐水。A、B组分别于压迫过程中第1、3、7、14、28天取材，每组每个时间点6只动物。

    1.4  行为学检查  慢性压迫性脊髓损伤后1、3、7、14、28 d对动物进行行为学检查，采用改良的Tarlov评分［1］和斜板试验［2］。

    1.5  病理标本制备  分别于不同时间点取材［3］，采用TUNEL观察各组细胞凋亡率。TUNEL检测凋亡试剂盒为武汉博士德产品，严格按照产品说明书步骤操作。

    1.6  图像分析  各组各时间点随机计数6张切片(损伤段、损伤上段、损伤下段各2张)，经机图像分析系统处理，分别测出每张切片凋亡细胞指数(AI)及每 mm2阳性细胞数。结果判定以细胞核中出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。采用高清晰度彩色病理图像分析系统，进行图像半定量分析。应用凋亡细胞核数估计凋亡细胞，根据下列公式计算：AI＝凋亡细胞核数/总细胞核数。

    1.7  统计学分析  所有数据行多样本均数单因素方差分析或两样本均数的t检验，以±s表示，以α＝0.05为检验水准进行双侧检验。使用SPSS 10.0统计软件进行统计分析。

    2  结    果

    2.1  行为学检查  采用改良的Tarlov评分和斜板试验检测结果显示，慢性压迫性脊髓损伤后60只大鼠均出现不同程度后肢瘫痪，排尿障碍。A组运动功能恢复良好，尿潴留有所缓解，与B组比较差异有显著性差异(P＜0.05)(见表1)。表1  大鼠慢性压迫性脊髓损伤Tarlov评分和斜板试验结果

    2.2  各组细胞凋亡指数及凋亡率  通过对组织染色切片的图像分析和统计学检验，A组的细胞凋亡指数和凋亡率均小于B组(P＜0.05)(见表2～3)。 表2  大鼠慢性压迫性脊髓损伤后神经细胞凋亡指数结果

    2.3  病检查  光镜下观察B组切片，可见神经元细胞水肿，丧失典型的多极形态。胞核偏位，尼氏小体丧失，噬神经元现象明显。轴突纤维排列结构紊乱，髓鞘脱失，星形胶质细胞和少突胶质细胞增生，有卫星现象。部分神经元细胞缩小呈三角形，胞核浓缩深染，呈缺血性改变，亦可见明显灶性表3  大鼠慢性压迫性脊髓损伤后神经细胞凋亡率结果

    出血坏死区及炎性细胞浸润。A组切片可见脊髓灰质轻度水肿，神经元肿胀减轻，有少量胶质细胞和星形胶质细胞增生，白质胶质细胞增生明显，可见病理改变较B组有所减轻(见图1～4)。

    3  讨    论

    本研究发现在大鼠慢性脊髓压迫损伤模型中，阿司匹林组的神经细胞凋亡率低于空白对照组(P＜0.05)，提示阿司匹林对大鼠慢性脊髓压迫损伤后神经细胞凋亡有保护作用。图1  慢性压迫性脊髓损伤后7 d阿司匹林治疗组脊髓组

    近来研究认为，阿司匹林可通过对环氧化酶?2(Cyclooxygenases，COX?2)的作用、抑制核因子?κB(NF?κB)激活、对蛋白激酶Cζ(protein kinase Cζ，PKCζ)的作用、调控NOS表达等途径抑制神经细胞凋亡，发挥神经保护作用。已知COX主要有COX?1、COX?2两种表型，在脊髓神经元中COX?2的表达占绝对优势［4］，且COX?2表达峰值与谷氨酸浓度呈正相关图4  慢性压迫性脊髓损伤后28 d阿司匹林组脊髓组性［5］。COX?2的过度表达亦可使大鼠中枢神经的兴奋性氨基酸神经兴奋毒性增强［6］。提示COX?2表达与脊髓压迫的损伤因素密切相关，是兴奋性氨基酸的神经毒性以及一氧化氮和NMDA介导的神经细胞死亡中的一个重要环节。阿司匹林通过对脊髓中丰富表达的COX?2的抑制，可完全抑制谷氨酸对神经细胞的毒性损伤，减轻NMDA介导的神经毒性。同时抑制脊髓前列腺素合成，减少细胞黏附和细胞膜的粘性，减轻脊髓炎性反应。NF?κB能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强κB序列特异结合，广泛存在于各种细胞中，在细胞受到损伤因素刺激后可被活化，增强多种炎症介质的转录。阿司匹林可特异性抑制ATP与IκKβ的结合，阻滞胞浆核因子κB复合物中IκB的磷酸化，阻止蛋白酶对IκB的降解，使NF?κB的信号通路受阻，对抗谷氨酸神经兴奋毒性来保护神经元［7，8］，并减轻脊髓受损段的炎性反应。此外阿司匹林还可保护在磷脂酰肌醇代谢中起重要作用的PKCζ免于NMDA诱导活化，并抑止PKCζ的蛋白激酶活性，防止其发生转位并启动神经细胞凋亡途径，引发神经退行性变［9，10］。另外，脊髓损伤时产生过量的NO，通过超氧自由基的细胞毒性作用，造成细胞蛋白质、核酸和脂质膜损伤，并激活COX?2［11］。同时，受TNF?α介导的星形胶质细胞释放大量谷氨酸，使NMDA受体依赖性的钙通道开放，引发Ca2＋内流，激活NOS生成NO，继而激活鸟苷酸环化酶，升高cGMP水平，促使细胞凋亡［12，13］。阿司匹林可通过抑制中枢和外周神经细胞的iNOS，减少NO生成，并直接清除NO［14，15］，抑制关联损伤因子的释放发挥神经细胞的抗凋亡作用。此外，阿司匹林还可延缓神经细胞低氧状态下胞外ATP的减少，恢复ATP水平，抑制谷氨酸释放［16］。

    有研究报道［17］，对大鼠大脑中动脉梗死模型一次性给予阿司匹林，8 d后处死，与空白组对照有明显神经保护作用。在MPTP诱导的Parkinson′s疾病模型中［18］，以50 mg/kg阿司匹林预处理的大鼠7 d后取材观察，发现阿司匹林可明显减缓多巴胺的减少。提示一次性给予大剂量阿司匹林其最大神经保护效能在体内可至少持续7 d以上。在大鼠慢性脊髓压迫模型中给予大剂量甲基强的松龙，第14、28天与空白组对照神经元凋亡情况均有显著性差异［3］。以上研究提示在大鼠脊髓压迫损伤中抑制神经元凋亡的干预具有非剂量相关的长时效性。本实验采用术后间断性大剂量给药方式，不同时间点神经元凋亡结果对比具有显著性差异，可能是慢性脊髓压迫性损伤后，神经元的抗凋亡途径以及内源性保护机制存在相关治疗干预的长效应靶点，使阿司匹林不需完全依赖体内药物代谢动力而发挥神经细胞的抗凋亡作用。但具体的效应机制仍需我们进一步探索。

    综上所述，在慢性脊髓压迫损伤后给予阿司匹林，可以减少神经元凋亡，缓解相应症状，对此类疾病治疗有积极作用。其抑制神经元凋亡的机制和分子水平途径有待我们进一步研究。

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