自体骨髓干细胞移植治疗下肢动脉缺血性疾病的疗效观察
作者：侯向前 吴学君 张精勇 金星 吕晓霞 钟振岳 张十一 董典宁 孙岩
【摘要】 目的：观察自体骨髓干细胞移植下肢动脉缺血性疾病的临床疗效及影响因素。方法：28例下肢动脉缺血患者，均抽取自体骨髓血，体外提取单个核细胞，行缺血下肢局部肌肉注射，术后观察各项指标综合评估。将患者分为高浓度注射组和低浓度注射组，比较两组移植前后缺血改善情况。结果：28例患者总的疼痛缓解率及麻木感和冷感缓解率均为100%，5例溃疡出现愈合迹象，移植后临床评分（10.96±2.09）低于移植前（14.25±2.41），P＜0.05；高浓度注射组注射前后评分差值（3.92±1.16）大于低浓度注射组(2.81±1.52，P＜0.05。除1例于术后3个月出现浅静脉曲张外，未发现明显并发症。结论：自体骨髓干细胞移植治疗下肢动脉缺血性疾病是一种安全、有效的手段。干细胞提取的数量、动脉缺血的范围，尤其是干细胞注射浓度对于其治疗效果有重要影响。
【关键词】 骨髓祖代细胞 移植 自体 腿 缺血
Clinical efficacy and influcing factors of autologous transplantation of bone marrow mononuclear cells in the treatment of lower extremity ischemic disorders
【ABSTRACT】 Objective：To observe the clinical efficacy and analyze the influcing factors of autologous transplantation of bone marrow mononuclear cells in the treatment of lower extremity ischemic disorders. Methods：Totally 28 cases were treated by autologous transplantation of bone marrow mononuclear cells. After aspiration of bone marrow blood from the iliums，the mononuclear cells were separated and then injected into the skeletal muscles of the ischemic legs. The clinical and laboratory findings were monitored after the surgery. Then the cases were divided into two groups by the concentration of the bone marrow mononuclear cells injected into the muscles. The improvement degrees of the two groups were compared. Results: The low limb pain alleviating rate was 100% as well as the skin turning warm and the insensible feeling alleviating rate, there was the sign of ulcer healing in 5 case. The clinical score after the transplantation (10.96±2.09) was lower than that before the transplantation(14.25±2.41),P＜0.05. The difference value of the group treated with higher mononuclear cells before and after the plantation is significantly higher than that of the group with lower mononuclear cells. No complications was found except 1 case appeared superficial varicosis. Conclusions: Autologous transplantation of bone marrow mononuclear cells could be a safe and effective method for treating patients with lower extremity ischemic disorder. The quantity of the mononuclear cells, the extent of ischemia, especially the concentration of the mononuclear cells injected into the muscles significantly influent the result of the treatment.
【KEY WORDS】 Myoloid progenitor cells·Transplantation, autologous·Leg·Ischemia
对于无流出道的难治性下肢缺血性疾病，尤其是糖尿病足，旁路手术和介入治疗均无法实施，药物治疗效果不佳，截肢率高，给病人造成巨大痛苦［1］。有报道自体骨髓干细胞移植治疗这类病人取得较好的效果［2］。本研究用自体干细胞移植治疗28例病人，探讨干细胞移植治疗下肢动脉缺血的疗效及其影响因素，报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 山东省立血管外科2004年9月～2005年12月收治的下肢动脉缺血且流出道不良的患者28例，均不能行动脉搭桥或者介入治疗，并符合干细胞移植指征。男19例,女9例，年龄32～83岁，平均65岁。动脉硬化闭塞症18例，血栓闭塞性脉管炎4例，糖尿病足6例。全部患者均有足部和（或）下肢发凉、麻木、疼痛和间歇性跛行。到静息痛22例，伴皮肤溃疡7例，伴足趾坏疽3例，合并感染6例，2例一侧肢体已行截肢手术。28例中合并高血压22例，冠心病18例，糖尿病12例，血脂异常23例 。2例曾行血管内支架置入术，术后再次闭塞或严重狭窄。
1.2 干细胞移植的指征 适应证：慢性下肢动脉缺血患者，间歇性跛行且踝/肱指数（ABI）＜0.6，或有静息痛、溃疡、坏疽，保守治疗无好转且不适合外科搭桥手术的患者。禁忌证：控制不好的糖尿病患者，过去5年内明确有恶性疾病的患者及血中肿瘤标志物水平明显升高者，严重心、肝、肾、肺功能衰竭或一般状况很差不能耐受干细胞移植手术者。
1.3 患者肢体缺血程度临床评分 所有患者均根据怕冷程度、麻木感、疼痛程度、间歇性跛行距离、溃疡情况、有无感染及踝肱指数等指标进行临床评分，评分标准见表1。
1.4 辅助检查 28例均经下肢血管彩色多普勒、CT血管成像和（或）动脉造影检查，股浅动脉、股深动脉狭窄或者闭塞24例，腘动脉狭窄或者闭塞20例，28例均有不同程度的胫前动脉、胫后动脉或腓动脉狭窄或者闭塞。
1.5 移植方法 移植前进行骨髓像评估，发现2例骨髓增殖减低，应用粒、单核细胞集落刺激因子，4 d后复查明显好转。局麻下抽取自体骨髓200～400 ml，在体外经过淋巴细胞分离液处理、离心后，提取单个核细胞层，并进行细胞计数。将提取的单个核细胞稀释成悬液，50～120 ml，在硬膜外麻醉下，根据缺血范围选取缺血肢体大腿中下段及小腿部前、后、外肌群肌肉注射，0.5 ml/穿刺点，间隔1 cm，共6排。患者的干细胞注射浓度。干细胞注射浓度（个/ml） =总细胞计数（个） / [每个穿刺点注射剂量 （ml） ×穿刺点总数]
1.6 随访 所有患者均获得随访，时间为1～12个月，平均8.5个月。
1.7 统计学处理 应用自身配对资料的t检验，比较28例患者移植前与后临床评分。根据干细胞注射浓度，将28个患者分为高浓度组（≥107个/ml）12例和低浓度组（＜107个/ml）16例，比较两组移植前后临床评分差值。采用SPSS11.5统计软件包进行分析，所有的数据使用x±s表示，P ≤0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 临床症状与体征变化情况 抽取骨髓过程中，除1例出现乏力，第2天好转外，其余患者均无异常。干细胞移植过程顺利，术后100％（28/28）疼痛和麻木感消失或者减轻，50％（14/28）静息痛消失或明显减轻，7%(2/28)跛行距离由不足50 m提高到>100 m，71%(5/7)伴有溃疡的患者，溃疡愈合或面积逐渐减小，18％（5/28）ABI增加>0.1。4％（1/28）症状无改善。29%（8/28）于术后1个月缺血症状再次加重，其中3例表现为跛行距离减至术前水平，2例术前有静息痛者再次出现静息痛，3例表现为晚间患肢麻木、怕冷，但无难以忍受的疼痛。1例于术后2个月行膝下截肢手术，术中发现残端血运丰富，术后创面愈合良好。2例足趾坏疽的患者症状明显缓解，静息痛消失，行坏疽足趾切除，愈合良好。1例足趾坏疽患者疼痛消失，睡眠改善，坏疽组织有脱落迹象，未进一步处理。全部患者除1例于术后3月出现浅静脉曲张外，未发现明显并发症。
2.2 缺血情况评分 28例移植后临床评分（10.96±2.09）低于手术前临床评分（14.25±2.41），P＜0.05。手术前后评分差值高浓度移植组（3.92±1.16）大于低浓度移植组（2.81±1.52），P＜0.05。
3 讨论
下肢缺血性疾病已成为老年人多发病，是截肢致残的主要原因。对于病情重、动脉远端流出道不理想的患者，缺乏有效的措施。
20世纪90年代后期，有人提出了血管再生的设想，并通过大量基础研究和动物实验证实了这是一种治疗缺血性疾病的可行方法［3，4］。Kawamura等证实，在体外，来源于骨髓细胞CD34+ 细胞的某一亚群能分化形成内皮祖细胞，在体内能被诱导形成小血管的内表面，而且已证实，骨髓基质干细胞细胞能分泌诸如碱性成纤维细胞因子和促使血管假体管腔内表面内皮化的细胞因子，促进血管再生［5，6］。在临床实践中，Tateishi-Yuyama 等[2]首次报道应用自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病，开创了血管新生在临床应用的先例;国内也陆续开展了骨髓干细胞移植以及外周血干细胞治疗下肢动脉缺血性疾病，取得了较好的疗效［7，8］。
本组资料发现，所有患者骨髓干细胞移植术后临床评分均有下降，症状均有不同程度的缓解，说明自体骨髓干细胞移植治疗动脉缺血是有效的。在本组患者中，1例沿坏死组织边缘切除坏死组织，血运丰富，创口愈合顺利；另1截肢病例踝部坏疽行膝下截肢，术中见残端血运丰富，术后创面愈合良好。而一般为保证截肢创面愈合，截肢平面常选择在坏疽部位的近侧关节上方，即若踝关节处皮肤坏疽，截肢平面应选择在膝上。截肢平面下降，创面愈合良好，可能与干细胞移植增加患肢的血运有关。所有患者在手术后第1天即感到肢体疼痛减轻、皮温增高，不适感明显减轻。由于此时干细胞还不可能发生作用，考虑为干细胞移植时采用硬膜外麻醉，下肢动脉痉挛被暂时缓解，下肢血供增加，以及注射干细胞悬浊液中液体成分所导致的炎症反应等引起。
目前报道干细胞移植治疗下肢动脉缺血有效性的文章较多，Kobayashi等［9］认为自体骨髓干细胞移植具有非剂量依赖性，缺血局部注射1×106、5×106个/ml、1×107个/ml的骨髓悬液总体积50 μl均可以明显地增加毛细血管的生成。本研究发现，虽然高浓度和低浓度的骨髓基质干细胞移植都可以改善肢体的症状，但不同患者疗效差异较大，高浓度组效果明显好于低浓度组。可能是作为种子细胞的基质干细胞在我们所提取得单个核细胞中仅占0.2%，注射浓度过低导致有效细胞数量少，新生血管数量不足，因而低浓度组疗效欠佳。所以本研究显示动脉闭塞段过长，抽取骨髓血的量过少或提取的单个核细胞数量过少，都将导致注射浓度偏低，影响疗效。对于这类病人，可以术前使用细胞集落刺激因子（C-SF），提高细胞含量，或者进行多次干细胞移植，以提高疗效。
理论上讲，自体干细胞是一种比较安全的干细胞来源［10］，但由于干细胞是未分化细胞,目前尚不能完全排除移植的干细胞分化为其他组织，甚至出现肿瘤样生长的可能，不能肯定会否促进体内潜在的恶性肿瘤生长，会否恶化糖尿病眼底病变导致失明。尽管目前报告的临床研究均未观察到严重不良反应，但其样本量小，时间短，不能成为有力依据。这些安全方面的问题仍需密切关注。本组1例患者术后3个月出现浅静脉曲张、增多，可能与干细胞移植治疗致血管新生有关，但亦可能是干细胞移植治疗后组织血供增加，静脉充盈，使原来未显示的曲张浅静脉得以显露。
自体干细胞移植治疗动脉缺血具有一定的疗效，其治疗效果与干细胞提取数量、动脉缺血范围尤其是注射浓度有很大关系。我们应当严密、长期地观察干细胞移植的并发症，尤其注意血管瘤发生的可能性。
【】
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