低剂量1318nm Nd:YAG激光对体外胰腺癌细胞增殖的影响
作者：刘建刚 刘志超 杨景庚 杨在富
【摘要】 目的：研究低剂量1318nm Nd:YAG激光的生物学效应。方法：用波长为1318nm的Nd:YAG激光连续照射体外培养的处于对数生长期的人胰腺癌PC-3细胞， 分组分别照射0s、2s、4s、6s、8s、10s、12s、14s，每天1次，照射3次后，继续培养24h，噻唑蓝比色法（MTT）测定各组OD值，研究细胞增殖情况。结果： 随着激光照射剂量的提高，PC-3细胞的OD值逐渐升高 (P <0.05) 。 结论：1318nm Nd:YAG激光，在低剂量范围内照射PC-3细胞，具有明显促进其增殖的作用，且呈剂量依赖性，在临床应用上应避免该副作用的发生。
【关键词】 Nd:YAG激光· 胰腺肿瘤·肿瘤细胞·比色法
Effect of low intensity 1318nm Nd:YAG Laser irradiation on human pancreatic carcinoma cells (PC-3) proliferation in vitro
【ABSTRACT】 Objectives: To investigate the biological effect of low intensity 1318nm Nd:YAG laser on human pancreatic carcinoma cells (PC-3). Methods: Eight groups of PC-3 cells were cultured in 96-well plates for 12h and then irradiated with 1318nm Nd:YAG continuous wave laser for different time intervals (0 s、2 s、4 s、6 s、8 s、10 s、12 s、14 s). The laser power was 1.7W and spot diameter 5mm (laser dose 0~121.27J/cm2). Cells were irradiated once a day and totally 3 days and cultured for a next 24h. MTT was used to assess the cell proliferation. Results: A significant stimulative effect of 1318nm laser on PC-3 cell proliferation was found (P <0.05). Conclusion: The PC-3 cell proliferation may be stimulated by low intensity 1318nm Nd:YAG continuous wave laser, which suggests that this laser could be potentially harmful to patients with pancreatic carcinoma.
【KEY WORDS】 Nd:YAG laser· Human pancreatic carcinoma cells · Cells culture
激光肿瘤，选择性强，对正常组织无损伤，患者痛苦小，无严重不良反应，是一种安全有效的治疗方法。目前认为激光抗肿瘤作用主要是利用它的热效应和光动力学效应，还可能与免疫有关［１］。但有报道证实低剂量氦氖激光对某些肿瘤细胞却有增殖作用［2-4］。本研究选用国内外尚未见报道的人胰腺癌细胞作为靶细胞，探讨低剂量1318nmNd:YAG激光对其增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 主要材料
牛血清白蛋白，噻唑蓝（MTT），二甲基亚砜（DMSO），台盼蓝均购自美国Sigma公司；高糖DMEM培养基，购自美国Hyclone公司；胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司生产。
CO2恒温培养箱，美国Baxter公司制造；Multiskan MK3型酶标仪，产地上海；多功能倒置显微镜日本Nikon公司生产；Nd:YAG激光器，院物理所提供；EP1000D型激光功率能量计，军事医学科学院二所提供。
胰腺癌PC-3细胞系，中国人民解放军302肝胆研究中心赠送。
1.2 方法
1.2.1 细胞准备
将胰腺癌PC-3细胞系在含10%热灭活胎牛血清、100IU/ml青霉素和100 mg/ml 链霉素的高糖DMEM培养基上，37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中传代培养，0.25%的胰酶消化。每2~3d传代1 次，取对数生长期细胞进行实验。
处于对数生长期的PC-3细胞用0.25%胰酶消化后，离心，高糖培养液混匀制成细胞悬液, 浓度为2.5×105个/ml，按实验设计小心加入96孔培养板。每孔40μl,任意2个有细胞的小孔间隔1个空白小孔，防止杂散激光干扰。所有加入细胞悬液的孔分为8组，每组6孔，各孔加入高糖培养液150μl，放入37℃ 5%CO2培养箱培养12h准备激光照射。
1.2.2 激光照射
如图1所示，光阑直径5mm，8组细胞分别照射0s（对照组）、2s、4s、6s、8s、10s、12s、14s。实验开始前、照射过程中和结束后各测一次透过光阑的激光功率，取其平均值1.70W（1.68~1.72W）。得到激光照射剂量分别为0J/cm2，17.32J/cm2，34.65J/cm2，51.97J/cm2，69.30J/cm2，86.62J/cm2，103.95J/cm2，121.27J/cm2。每天照射1次，连续照射3d。随后继续培养24h进行细胞形态观察和MTT检测。
1.3 细胞形状观察
将96孔培养板置于倒置显微镜下，调节焦距观察细胞的形状并摄片。
1.4 MTT检测
向96孔培养板各孔加入MTT液（5mg/ml）20μl，振荡，继续培养4h，小心吸去培养液，加入DMSO150μl/孔，室温下微孔板震荡10min，酶标仪波长492nm处测定OD值。
1.5 统计学处理
本实验采用成组设计t检验，应用SPSS11.5软件包对OD值进行统计分析，双侧α=0.05。
2 结果
2.1 各实验组PC-3细胞OD值见表1。与对照组相比，2s组P>0.05，4s组P<0.05，其余各组P<0.01。
2.2 光镜下细胞的形态：在光学显微镜下可见对照组细胞密度明显低于实验组（图3）。
3 讨论
胰腺癌是临床上一种常见的消化系统肿瘤，由于其起病隐匿，发现晚，快，早期出现转移，临床上根治性切除率低。Nd:YAG激光是近年来在肿瘤的方面应用较广的一种治疗技术。我们通过低剂量1318nm Nd:YAG激光照射胰腺癌细胞，用MTT法检测细胞的生长情况，为临床上Nd:YAG激光的应用提供一定的理论依据。
本研究结果显示1318nm Nd:YAG激光在低剂量的范围内（34.65J/cm2~121.27J/cm2）对人胰腺癌PC-3细胞的增殖具有促进作用(P<0.05或P<0.01)，且随照射时间的延长、照射剂量的增大，逐渐增强。这可能是因为激光的照射,改变了细胞内Ca离子的浓度,激活蛋白激酶或磷酸酶，产生一系列蛋白磷酸化反应,向细胞内传递增殖信号,诱导核内基因表达，增加DNA的合成,从而促进了细胞的增殖 [2-3, 6-7]，但其具体机制尚需进一步探讨。
本研究结果提示, 应用激光治疗肿瘤时，较小剂量的1318nmNd:YAG激光在一定剂量范围内有促进胰腺癌PC-3细胞生长的作用，临床应用上应避免该副作用的发生。
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