血管疾病的蛋白质组学研究进展

    在后基因组时代，生物学家们的研究重心已经从解释生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究。生物功能的主要体现者是蛋白质，而蛋白质有其自身特有的活动，仅仅从基因的角度来研究远远不够。例如蛋白质的修饰加工、转运定位、结构变化、蛋白质与蛋白质的相互作用、蛋白质与其它生物分子的相互作用等活动规律，均无法从基因组水平上获知，因而产生了一门在整体水平上研究细胞蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科蛋白质组学（Proteomics），双向凝胶电泳（2DE）质谱（MS）生物信息学是蛋白质组学的经典技术路线，该领域已逐渐成为近年来许多学者的研究焦点［1］。

    心血管疾病已经成为近年威胁人类生命和健康最重要的杀手。蛋白质组学对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明疾病在生理或病理条件下的变化机制。心血管系统主要包括心脏本身及血管系统疾病，研究对象涉及心肌、心肌细胞、心肌线粒体、血管平滑肌、血管平滑肌细胞（SMC）和血管内皮细胞以及血管的内膜病变、粥样硬化斑块等。目前心血管系统的蛋白质组学研究已经广泛开展，主要集中在心脏疾病方面，主要涉及心肌病、心脏衰竭、心肌缺血、慢性应激、心脏衰老等［2～7］。心肌病尤其是扩张性心肌病蛋白质组学研究最受关注，早期研究多集中于心肌组织或细胞蛋白质的分离和鉴定，并构建和充实心血管的蛋白质组数据库。对于血管疾病的蛋白质组学研究却刚刚起步，研究报道不多，但应用蛋白质组学技术研究血管疾病必定是将来的趋势之一。为了使众多的血管疾病研究者们能够对这一新的研究领域及其现状有一个较全面了解，蛋白质组学在心血管疾病方面的研究进展将具有非常重要的意义。心脏方面的蛋白质组学研究进展国内已有综述报道，本文主要就近年来蛋白质组学方法在血管疾病研究中的进展作一综述，主要从血管组织和血管细胞蛋白质组学两个方面进行总结，血管组织主要包括粥样硬化动脉、粥样硬化斑块、静脉，而血管细胞主要是平滑肌细胞（SMC）及血管内皮细胞。

    1  血管组织

    1.1  粥样硬化动脉及斑块  动脉粥样硬化是血管疾病的重要病变，参与许多血管疾病的发病过程。Duran等［8］将正常动脉、颈动脉内膜切除术中得到的非复杂性斑块、复杂性斑块分别培养，然后用2DE分析分泌蛋白，结果显示粥样硬化动脉分泌的蛋白数量较正常明显增高，且病变越复杂，分泌的蛋白质数量越多。将蛋白质组的方法运用于寻找冠状动脉粥样硬化的生物标志物研究［8］，发现冠状动脉病患者的铁蛋白轻链表达显著增加，其通过氧自由基的产生调节血管壁内脂类的氧化状态，加速冠状动脉粥样硬化的产生。Kaul等［10］探讨受体Ck的功能蛋白质组学和人动脉粥样硬化主动脉壁阶段之间的关系，结果显示从正常动脉到粥样硬化动脉斑块，受体Ck基因表达逐渐增加，固醇反应元件结合蛋白、p27、细胞周期调节蛋白D、白介素6和CD40的基因编码效应子的调节反应也逐渐增加，提出胆固醇特异性的受体Ck依赖性的基因调节可能在动脉粥样硬化形成中具有重要作用。国内学者将蛋白质组学技术应用于药物研究［11］：给予高脂饮食8周的兔喂养辛伐他丁4周，观察该药抑制动脉粥样硬化的疗效，结果显示辛伐他丁促进血液中的脂质代谢，但粥样硬化动脉壁的内层病变并未恢复。目前尚无应用蛋白质组学方法研究其他动脉如主动脉和肢体动脉等的研究报道。

    1.2  静  脉  大隐静脉是血管旁路术常用的自体移植物。动脉旁路术经历从低血压、搏动微小的静脉循环到变成高压力的搏动性动脉循环，适应这种变化的血液动力学环境是移植物成功和通畅的关键。McGregor等［12、13］首先用于2DE和MS方法探讨了正常大隐静脉中膜平滑肌的蛋白质组学，鉴定了其中129个蛋白点，然后探讨移植静脉对动脉血液动力学的适应性反应，发现大隐静脉移植物暴露于动脉血液动力学应力后，丝状肌动蛋白成帽（CapZ）、HSP27和其他的收缩表型相关的SMC蛋白质表达发生变化，提示收缩型大隐静脉SMC对血液动力学刺激产生了适应性反应。血管痉挛和内膜增厚也可导致移植物失败。Tessier等［14］合成了热休克相关蛋白质HSP20的拟生态同型肽段PTDPHSP20和具有相同氨基酸的杂乱序列PTDscHSP20，观察肽段对SMC增殖和迁移的作用，结果发现PTDpHSP20可引起静脉舒张，且更显著抑制SMC的迁移，而两者对SMC的增殖影响无明显区别。HSP20生物活性序列的蛋白转导影响大隐静脉的病理生理反应，其呈现了一种新颖的蛋白质组学基础上的治疗策略，这种合成的肽段可以防止体外的人大隐静脉段痉挛和内膜增厚。

    2  血管细胞

    2.1  血管平滑肌细胞  SMC是血管壁中层最主要的细胞组分，在多种疾病的血管重构中起着重要作用。Dupont等［15］培养了人乳腺内动脉来源的SMCs，对培养的SMCs细胞裂解物及其分泌上清的蛋白质组学进行研究，获得了体外培养的SMCs的蛋白质组学和分泌组学图谱，这两张参考图谱对于将来研究疾病中SMCs的蛋白质组学及其作用机制具有重要的参考意义。Mayr等［16］已证实PKCδ缺乏的大鼠与野生型大鼠相比，新内膜形成明显增加，以联合蛋白质组学和代谢方法分析来源于PKCδ＋／＋和PKCδ－／－大鼠的SMC，发现PKCδ－／－大鼠SMC中有30种以上的蛋白质发生改变，包括与糖和脂质代谢及谷胱甘肽再循环有关的酶、伴侣分子和细胞骨架蛋白。SMC增殖力增强是动脉粥样硬化病理机制中的关键事件。转化生长因子β（TGFβ）是SMC增殖的一种抑制剂，Khanna［17］也应用2DE研究正常SMC和TGFβ处理的SMC，分析与细胞增殖和动脉粥样硬化有关的差异表达蛋白。SMC凋亡也是血管疾病的重要病理机制。研究表明喹巴因可通过阻断Na+/K+―ATP酶抑制SMC凋亡。Taurin等［18］通过2DE对喹巴因处理的SMC和对照SMC的疏水和亲水蛋白进行分离，鉴定出一种有趣的蛋白mortalin。后续研究发现，阻断mortalin的表达可延缓SMC凋亡发生，且可抑制P53的活性。SMC也参与高血压的血管重构，肾血管性高血压以肾动脉的狭窄和围绕入球小动脉的产肾素细胞募集产生的高血浆肾素水平为特点，Pinet等［9］用钳夹一个肾制成大鼠肾血管性高血压模型，分离肾小动脉后，用2DEMS方法发现肌钙蛋白T在钳夹肾的入球小动脉中明显下调，且肌钙蛋白T对于平滑肌表型是特异性的，而在肌上皮样细胞中是缺乏的。

    2.2  内皮细胞  内皮细胞是血管的重要组成成分，在多种病理生理过程中具有重要作用，如凝血、血管内稳态、炎症反应、动脉粥样硬化、新血管生成和肿瘤转移扩散。早期PortigⅠ等［20］利用2DE分离内皮细胞中的应激蛋白，通过免疫印迹和氨基酸序列分析，鉴定出一系列如泛素、HSP等应激相关蛋白。Bruneel等［21］用蛋白质组学方法鉴定出体外培养的静止期人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中的53个蛋白质，包括细胞骨架蛋白，参与细胞活力和可塑性的蛋白，调节细胞凋亡与衰老的蛋白，参与凝血、抗原提呈蛋白和能量产生的蛋白。体内内皮细胞的复制衰老促进年龄相关的血管疾病的发生如动脉粥样硬化，Kamino等［22］应用2DE比较衰老和年轻的HUVECs的差异蛋白表达，结果发现衰老HUVECs与年轻HUVECs相比，有3个蛋白上调和5个蛋白下调，而在原代的人成纤维细胞的复制衰老中并未观察到这些改变。其中组织蛋白酶B，是参与细胞内蛋白水解和细胞外基质重构的蛋白酶，在HUVECs衰老中显著增高，其活性在与体内衰老相关的动脉粥样病变中是上调的。其他包括细胞骨架蛋白和参与合成、转化和修饰过程的蛋白质也被鉴定出，它们在内皮中的功能并未不清楚。Sprenger 等［23］也应用蛋白质组学技术研究了内皮细胞的两个脂质成分子域的差异蛋白表达。对冠状动脉内皮亦有研究报道，Yu等应用［24］卡巴胆碱刺激冠状动脉内皮细胞，观察蛋白质组的改变，发现有数十种蛋白质表达量发生变化，其中最有意义的是有4个新合成的蛋白均属于热休克家族。用2DE观察人内皮细胞暴露于移动电话的辐射后蛋白质表达的变化，发现辐射后有38个蛋白质表达水平明显变化，其中两个蛋白被证明是细胞骨架弹力蛋白的亚型，表明移动电话辐射可能影响细胞骨架蛋白，且对调节细胞骨架的生理功能具有一定的影响［25］。

    综上所述，蛋白质组学从整体、动态、水平上对蛋白质的研究，为诠释复杂的生命活动提供了新的视角，蛋白质组学技术的不断进展为疾病的诊断和新药的开发提供有力的工具，将使得我们能更全面更深入地了解血管疾病潜在的分子机制。

    参  考  文  献

    ［1］Blackstock W,Mann M.A boundless future for proteomics［J］.Trends Biotechnol,2001,19(supp):s1s2.

    ［2］Weekes J,Wheeler CH,Yan JX,et al.Bovine dilated cardiomyopathy:proteomics analysis of an animal model of human dilated cardiomyopathy［J］.Electrophoresis,1999,20(4~5):898906.

    ［3］Corbett JM,Why HJ,Wheeler CH,et al.Cardiac protein abnormalities in dilated cardiomyopathy detected by twodimensional polyacrylamide gel lectrophoresis［J］.Electrophoresis,1998，19（11）：20312042.

    ［4］Heinke MY,Wheeler CH,Yan JX,et al.Changes in myocardial protein expression in pacinginduced canine heart failure［J］.Electrophoresis，1999,20(10):20862093.

    ［5］Sawicki G,Jugdutt BI.Detection of regional changes in protein levels in the in vivo canine model of acute heart failure following ischemiareperfusion injury:functional proteomics studies［J］.Proteomics，2004,4(7):21952202.

    ［6］Kanski J,Behring A,Pelling J, et al.Proteomic identification of 3nitrotyrosinecontaining rat cardiac proteins:effects of biological aging［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,288(1):H371381.

    ［7］Liu XH,Qian LJ,Gong JB,et al.Proteomic analysis of mitochondrial proteins in cardiomyocytes from chronic stressed rat［J］.Proteomics,2004,4(10):31673176.

    ［8］Duran MC,Mas S,MartinVentura JL,et al.Proteomic analysis of human vessels :application to atherosclerotic plaques［J］.Proteomics，2003,3(6):973978.

    ［9］You SA,Archacki SR,Angheloiu G,et al.Proteomic approach to coronary atherosclerosis shows ferritin light chain as a significant marker:evidence consistent with iron hypothesis in atherosclerosis［J］.Physiol Genomics,2003,13:2530.

    ［10］Kaul D,Kaur R,Baba I,et al.Functional proteomics of receptorCk in the developmental stages of human atherosclerotic arterial wall［J］.Indian Heart J，2003,55(3):252255.

    ［11］Yu YL,Rui YC,Yang PY,et al.Studies on the simvastatin effect on the artery of atherosclerotic rabbit using proteomics approaches［J］.Acta Pharm Sin,2003,38(7):511514.

    ［12］McGregor E,Kempster L,Wait R,et al.Identification and mapping of human saphenous vein medial smooth muscle proteins by twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis［J］.Proteomics,2001，1:14051414.

    ［13］McGregor E,Kempster L,Wait R,et al.Factin capping (CapZ)and other contractile saphenous vein smooth muscle proteins are altered by hemodynamic stress:a proteonomic approach［J］.Mol Cell Proteomics,2004,3(2):115124.

    ［14］Tessier DJ,Komalavilas P,Liu B,et al.Transduction of peptide analogs of the small heat shockrelated protein HSP20 inhibits intimal hyperplasia［J］.J Vasc Surg,2004,40(1):106114.

    ［15］Dupont A,Corseaux D,Dekeyzer O,et al.The proteome and secretome of human arterial smooth muscle cells［J］.Proteomics,2005，5：585596.

    ［16］Mayr M,Siow R,Chung YL,et al.Proteomic and metabolomic analysis of vascular smooth muscle cells:role of PKCdelta［J］.Circ Res，2004,94(10):e8796.

    ［17］Khanna A.Concerted effect of transforming growth factorbeta,cyclin inhibitor p21,and cmyc on smooth muscle cell proliferation［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004,286(3):H11331140.

    ［18］Taurin S,Seyrantepe V,Orlov SN,et al.Proteome analysis and functional expression identify mortalin as an antiapototic gene induced by elevation of ［Na+］i/［K+］i ratio in cultured vascular smooth muscle cells ［J］.Circ Res,2002,91(10):915922.

    ［19］Pinet F,Poirier F,Fuchs S,et al.Troponin T as a marker of differentiation revealed by proteomic analysis in renal arterioles［J］.FASEB J，2004,18(3):585586.

    ［20］Portig I,Pankuweit S,Lottspeich F, et al.Identification of stress proteins in endothelial cells .［J］.Electrophoresis，1996,17(4):803808.

    ［21］Bruneel A,Labas V,Mailloux A,et al.Proteomic study of human umbilical vein endothelial cells in culture［J］.Proteomics,2003,3(5):714723.

    ［22］Kamino H,Hiratsuka M,Toda T,et al.Searching for genes involved in arteriosclerosis:proteomic analysis of cultured human umbilical vein endothelial cells undergoing replicative senescence［J］.Cell Struct Funct,2003,28(6):495503.

    ［23］Sprenger RR,Speijer D,Back JW,et al.Comparative proteomics of human endothelial cell caveolae and rafts using twodimensional gel electrophoresis and mass spectrometry［J］.Electrophoresis,2004,25(1):156172.

    ［24］Yu M,Chen DM,Hu G,et al.Proteomic response analysis of endothelial cells of human coronary artery to stimulation with carbacho［J］.Acta Pharmacol Sin,2004，25(9):11241130.

    ［25］Muth E,Driscoll WJ,Smalstig A,et al.Proteomic analysis of rat atrial secretory granules:a platform for testable hypotheses［J］.Biochim Biophys Acta,2004，1699(1~2):263275.