肥大细胞膜稳定剂对大鼠重症急性胰腺炎肠组织保护作用的实验研究

                 作者：王红禄 孙家邦 张淑文 崔叶青 李非 刘爽

【摘要】目的：探讨肥大细胞（MC）稳定剂酮替芬对重症急性胰腺炎（SAP）大鼠肠道组织的保护作用。方法：SAP大鼠模型前或模型后30min给予酮替芬，模型后3h及6h取大鼠末端回肠组织行HE染色观察病理变化。甲苯胺蓝及免疫组化染色MC数目，测定髓过氧化物酶（MPO）活性了解中性粒细胞（PMN）聚集程度，Western Blot法检测类胰蛋白酶表达。结果：酮替芬应用组肠组织病理损害较SAP组明显减轻；酮替芬预处理组3h及6h甲苯胺蓝染色每高倍视野MC计数分别为1.21及1.08，相应时段SAP组MC计数为3.52及1.38，两组3h MC计数差异有统计学意义，6h MC计数差异无统计学意义；酮替芬早期组3h及6h MC计数为1.19及1.03，与酮替芬预处理组同时段比较差异无统计学意义；各组免疫组化染色MC计数亦呈上述趋势；酮替芬处理组MPO活性较SAP组明显降低；酮替芬处理组类胰蛋白酶表达较SAP组明显下降。结论：预防性或SAP早期应用酮替芬，可减轻SAP肠组织的损害。

    【关键词】胰腺炎，急性坏死性・肥大细胞・酮替芬・小肠・大鼠，SpragueDawley

    Experimental study of protective effects of mast cell stabilizer on ileum of rat with severe acute pancreatitis

     【ABSTRACT】Objective:To investigate the protective role of mast cells stabilizer on ileum of rats with severe acute pancreatitis(SAP).Methods:Ketotifen was intraperitoneal injected 30 minutes before or after SAP model,after 3 hours and 6 hours,terminal ileum was removed to make HE staining,to count the number of MC by the method of toluidine blue staining and immunohistochemistry staining,to measure the level of MPO and activation level of tryptase by western blot,and compare these parameters with those of SAP rats without ketotifen treatment.Results:The pathologic damage of ketotifen treatment group was lighter than SAP groups.The MC numbers per high visual field of 3h and 6h of ketotifen pretreatment group were 1.21 and 1.08,and the MC numbers of SAP group 3.52 and 1.38,there was significant difference between 3h groups,but no significant difference between 6h groups.There was no significant difference between the ketotifen pretreatment group and the early treatment group;the data of MC number by immunohistochemistry staining has the similar trend,and the activation level of MPO of ketitofen group was lower than SAP group,And the expression of tryptase in ketotifen group decreased compared with that of SAP group.Conclusion:MCs are activated in the early period of SAP,and induce damage of ileum.Pretreatment or early using of ketotifen can decrease the severity of ileum in SAP.

    【KEY WORDS】Pancreatitis,acute necrotizing・Mast cell・Ketotifen・Intestine,small・Rats,SpragueDawley    重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）发病机制仍未彻底阐明。肥大细胞（mast cell,MC）是一种重要炎症效应细胞，SAP时，MC激活释放的细胞因子及炎性介质，可导致肠粘膜屏障功能受损，肠内细菌及内毒素移位，发生胰腺及胰外器官感染等。酮替芬是一种MC稳定剂，通过稳定MC膜抑制MC的脱颗粒，降低炎性介质及细胞因子的释放，从而降低组织损害程度。本研究主要观察酮替芬对大鼠SAP肠组织的作用，现报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  动物及试剂  雄性SD大鼠72只，体重230~260g，购自军事医学院实验动物中心。牛磺胆酸钠、富马酸酮替芬、鼠抗人类胰蛋白酶单抗、邻联茴香胺二盐酸等主要试剂购自于美国Sigma公司。

    1.2  模型制备及分组  参照Aho［1］等的方法制备SAP动物模型，抽签法随机分为6组，每组12只。A组：假手术组，腹腔内注射纯水（pure water,PW）4ml/kg。30min后制作假手术模型，模型后3h及6h随机各取6只大鼠，取末端回肠组织10cm(距回盲部5cm)行HE染色、甲苯胺蓝染色及类胰蛋白酶免疫组化染色、酶显色法检测MPO髓过氧化物酶活性，Western blot法检测肥大细胞类胰蛋白酶（mast cell tryptase,MCT）表达。B组：SAP组，腹腔内注射PW后30min制作SAP模型，测定方案同A组。C组：SAP+酮替芬组，腹腔内注射0.025%酮替芬溶液1mg/kg，30min制作SAP模型，测定方案同A组。D、E、F 3组动物数量、制模方法、测定方案同A、B、C 3组，只是把制模前30min的相应干预改在制模后30min给予。

    1.3  观察肠组织病理变化HE染色  光镜下观察肠粘膜绒毛结构及形态的完整性，有无肠绒毛萎缩、上皮分离、炎性细胞浸润、绒毛破损、脱落现象，了解肠粘膜受损情况。

    1.4  甲苯胺蓝染色行MC计数  甲苯胺蓝液染色后，随机选10个高倍视野（×400），计算肠组织MC平均数目，并观察MC脱颗粒情况，从而判断MC的活性。

    1.5  类胰蛋白酶免疫组化染色MC计数  MCT染色胶片，利用IDA2000数码图像分析系统分析，随机取10个高倍视野行MC平均计数。

    1.6  回肠组织MPO活性检测  称取各组回肠组织100mg，剪碎后加入0.5%溴化十六烷基三甲胺（hexadecyltrimethyl ammonium bromide,HTAB）2ml，充分匀浆，反复冻融3次，超声粉碎后，12000r/min，4℃离心30min，取上清液0.1ml加邻联茴香胺反应液2.9ml。立即在紫外分光光度计460nm波长下扫描2min,记录第30s和第90s的光密度差值。

    MPO活力单位（U/g）=(△A460/min)/(11.3×所加组织量g/L反应液)

    1.7  Western blot法测定回肠组织MCT表达  聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、10%脱脂奶粉封闭后，加入1∶150稀释的鼠抗人类胰蛋白酶单抗，万向脱色摇床上4℃下过夜，弃去一抗。加入1∶2000碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG，室温下2h。碱性磷酸酶显色液显色，蛋白条带扫描储存，KDS1D图像转换系统测出每条带的平均灰度值。

    1.8  统计学处理  实验结果以（x±s）表示，采用SPSS11.5统计软件，3组资料比较，采用单因素方差分析，再行组间q检验；两组数据采用独立样本t检验。P＜0.05认为有统计学差异。

    2  结  果

    2.1  肠组织病理变化  A组：大鼠肠粘膜绒毛完整、无破损，无炎性细胞浸润，见图1。B组：3h见肠粘膜绒毛顶端上皮下间隙增大、粘膜层与固有层分离、炎性细胞浸润、绒毛顶端破损；6h见绒毛破损、断裂，见图2。C组：肠粘膜绒毛可见为粒细胞浸润、绒毛上皮顶端分离、绒毛萎缩，但绒毛结构尚保持完整，见图3。C组制模前后肠组织病理变化一致。

    2.2  甲苯胺蓝染色MC计数  A组：肠组织内MC数目少，体积小，MC呈非活化状态见图4。B组：3h 时MC数增多，体积增大，见图5；6h 时MC数较SAP 3h减少，见图6。C组：3h组与B组3h组肠组织MC数相比，差异有统计学意义；6h组3组MC数比较，差异无统计学意义，见表1、2。C组制模前后给同时段MC数，差异无统计学意义，见表3。

    2.3  类胰蛋白酶免疫组化染色  A组：肠组织免疫组化染色MC少见，且体积小，见图7。B组3h组MC增多，且体积增大，染色深，见图8；6h组MC数下降，染色深度较3h组降低。C组：3h与B组同时段组比较，MC数下降，染色变浅，见图9；6h组与B组相同时段比较，MC数变化不明显，见表1、2。C组制模前后同时段MC数差异无统计学意义，见表3。2.4  肠组织MPO活性  A组：3h组肠组织MPO活性即明显增强，6h组MPO活性增强更明显。B组：与B组相应时段比较，MPO活性明显降低，但仍高于A组；C组6h与3h相比，MPO活性明显增高，差异有统计学意义，见表1、2。D、E、F组制模前后给予酮替芬相同时段观察，MPO活性差异无统计学意义，见表3。  表1  3个制模前干预组肠组织甲苯胺蓝MC计数与类胰蛋白酶MC计数（个/高倍视野）、MPO活性（U/L）表2  3个制模后干预组肠组织甲苯胺蓝MC计数与类胰蛋白酶MC计数（个/高倍视野）、MPO活性（U/L）（x±s）组别[]MC（甲苯胺蓝）3h[]6h[]MC（类胰蛋白酶）表3  C组肠组织甲苯胺蓝MC计数与类胰蛋白酶MC计数（个/高倍视野）、MPO活性

    2.5  肠组织MCT表达  肠组织Western blot结果表明，无论是制模前干预还是制模后干预组，A组蛋白条带最浅，B组蛋白条带明显加深，C组各时段MCT条带深度较B组明显变浅，但较A组稍深。3h组与6h组比较，条带深度相似。见图10和表4。表4  制模前后干预肠组织Western blot条带平均灰度值

　　3  讨  论

    肠粘膜肥大细胞（intestinal mucosal mast cells,IMMC）存在于肠道粘膜固有层，与肠神经、血管相邻，和其它免疫细胞及神经系统通过神经肽和细胞因子相互作用，形成精密的调控网，维持正常的肠道生理功能。唐承薇等［2］认为，IMMC的过度活化与MODS的发病有关。IMMC的过度活化释放出大量的细胞因子及炎症介质，促使免疫亢进，加重病理损伤［3］。SAP时，IMMC被激活，后者脱颗粒释放细胞因子及炎性介质引起肠组织血管扩张，IMMC是肠道组织TNFα的主要来源，在所有产生TNFα的肠道细胞中，IMMC占其中的60%，TNFα是MODS时激活细胞级联反应，引起过度炎症反应的主要介质［4］。其所激活的嗜酸性粒细胞变性成分也可直接损伤肠上皮细胞。这些均导致肠粘膜通透性增加，肠内细菌移位，胰腺及胰外器官感染，继而启动MODS的发生。研究证实，SAP感染的胰腺及胰周培养出的细菌多数为大肠和末段回肠常驻菌，依次为大肠埃希杆菌属、变形杆菌属、类肠球菌属［5］。可见肠道细菌移位是导致胰腺及其它器官继发感染的重要原因。Andoh等［6］研究认为，MC在肠道缺血再灌注损伤中还起着重要作用。酮替芬通过稳定MC，降低对SAP肠道组织的损害。

    SAP时，中性粒细胞（polymorphonuclear,PMN）聚集及激活是肠组织损伤的重要因素。SAP时，MC激活释放PMN趋化因子，加重了PMN的聚集，MPO活性上升。聚集的PMN，一方面机械性堵塞毛细血管致微循环障碍；另一方面释放大量的炎性介质，加重肠组织的损伤。Dib等［7］给予急性胰腺炎大鼠MC稳定剂，显著减少了结肠和肺MPO的产生。表明MC稳定剂的应用减轻了组织中PMN的聚集，从而降低了SAP时肺脏及肠道组织中的炎症反应。

    MC在循环中以未分化的定向前体形式存在，易于聚集在炎症部分，并增殖为MC。SAP时，组织损伤释放的细胞因子和炎性介质，趋化MC前体进入炎症部位，分化增殖为成熟的MC。Yonetci等［8］于蛙皮素诱导的急性胰腺炎大鼠模型前30min给予酮替芬，明显减少了MC的数量，表明酮替芬通过稳定MC，减少了细胞因子及炎症介质的释放，从而减少了对MC的趋化作用，使肠组织中MC数量下降。MC脱颗粒释放的MCT是MC的主要蛋白酶，是MC活性的特异性标记蛋白。Mentula等［9］报道，发生MODS的SAP患者血清中MCT的峰值较未发生MODS者明显升高，表明MC的激活在SAP及其所致的MODS的发病机制中起着重要作用。

    参  考  文  献

    ［1］Aho HJ,Koskensalo ML,Nevalainen TJ.Experimental pancreatitis in the rat:sodium taurocholateinduced acute haemorrhagic pancreatitis［J］.Scand J Gastroenterol,1980,15:411416.

    ［2］唐承薇，蓝程.生长抑素抑制多器官功能衰竭时肠粘膜肥大细胞活性［J］.中华消化杂志，2003,23:461465.

    ［3］Donald EF,Mast cells.In:Baue AE eds.Multiple organ dysfunction syndrome［M］.New York:SpringerVerlag Press,2000.88195.

    ［4］Kollias G,Douni E,Kassiotis G,et al.On the role of tumor necrosis factor and receptors in models of multiorgan failure,rheumatoid arthritis,multiple sclerosis and inflammatory bowel disease［J］.Immunol Rev,1999,169:175194.

    ［5］Schwarz M,Thomsen J,Meyer H,et al.Frequency and time course of pancreatic and extrapancreatic bacterial infection in experimental acute pancreatitis in rats［J］.Surgery,2000,127:427432.

    ［6］Andoh A,Kukuda M,et al.Rapid intestinal ischaemiareperfusion injury is suppressed in genetically mast celldeficient Ws/Ws rats［J］.Clin Exp Immunol,1999,116:9093.

    ［7］Dib M,Zhao X,Wang XD,et al.Role of mast cells in the development of pancreatitisinduced multiple organ dysfunction［J］.Br J Surg,2002,89:172178.

    ［8］Mentula P,Kyalnpaa ML,Kemppainen E,et al.Serum levels of mast cell tryptase,vascular endothelial growth factor and basic fibrioblast growth factor in paitients with acute pancreatitis［J］.Pancreas,2003,27:e29e33.

    ［9］Yonetci N,Oruc N,Ozutemiz AO,et al.Effects of mastcell stabilization in ceruleininduced acute pancreatitis in rats［J］.Int J Pancreatol,2001,29:163171.