BRMS1在胃癌组织中的表达与淋巴结转移的关系

            作者：彭海　周文学　周昊昕　李云龙　邹小明

【摘要】  目的：探讨胃癌组织中乳腺癌转移抑制基因(breast cancer metastasis suppressor 1，BRMS1)mRNA表达水平与胃癌淋巴结转移之间的关系。方法：根据胃癌淋巴结转移情况，将66 例胃癌标本分为转移组(46例)和未转移组(20例)；以β-actin为内参照，用半定量RT-PCR方法检测66例胃癌组织中BRMS1 mRNA的表达。结果：BRMS1 mRNA在胃癌组织中的表达为0.441±0.096；BRMS1 mRNA在胃癌淋巴结转移组和未转移组中的表达分别为0.405±0.072、0.525±0.091，转移组BRMS1 mRNA的表达水平显著低于未转移组(P＜0.05)。结论：BRMS1 mRNA在胃癌组织中的表达水平与淋巴结转移呈负相关，而与病理类型、分化程度无相关性。

【关键词】  胃肿瘤 转移抑制基因 淋巴结 转移

    Relationship between the expression of BRMS1 mRNA and the metastasis of lymph node with gastric carcinoma

    【ABSTRACT】Objective: To study the relationship between the expression of breast cancer metastasis-suppressor 1 (BRMS1) mRNA and the metastasis of lymph node with gastric carcinoma. Methods: According to the metastasis of lymph node, 66 cases were divided into metastasis of lymph node group (n=46) and no metastasis of lymph node group (n=20). The expression of BRMS1 mRNA was determined by Semi-RT-PCR method (with reference β-actin). Results: The expression of BRMS1 mRNA was 0.441±0.096 in gastric neoplasms, and it was 0.405±0.072 and 0.525±0.091 respectively in metastasis of lymph node and no metastasis of lymph node. It was significantly lowered in metastasis group (P＜0.05). Conclusion: There was a negative relationship between the expression of BRMS1 mRNA and the metastasis of lymph node in gastric neoplasms, but was not correlated with the pathological type or split up degree.

    【KEY WORDS】 Gastric neoplasms·Metastasis suppressor genes· Lymph node·Metastasis　　乳腺癌转移抑制基因 (breast cancer metastasis suppressor 1, BRMS1)是2000 年新发现的肿瘤转移抑制基因［１］。研究表明除了乳腺癌，BRMS1在人的黑色素瘤和高度转移的膀胱癌细胞中的表达均有所降低［２］。2004年，通过大规模的基因表达差异分析发现在咽癌中其表达也与正常组织中的表达有差异［３］。但目前尚未见有BRMS1基因与胃癌之间相关性的报道。2006年5月～2006年12月本研究利用RT-PCR 检测BRMS1 mRNA在胃癌组织中的表达并观察其与胃癌临床病理特征的关系。

    1　资料与方法

    1.1　一般资料　收集哈尔滨医科大学附属第二临床2005年9月～2006年4月间66例胃癌患者的癌组织手术切除标本，组织均为离体后立即取材，剪成小块立即放入液氮，并转入-80 ℃冰箱保存待测。所有患者均行胃D2淋巴结清除根治术，术前均未行放化疗和内分泌。66例患者中年龄34～74岁，中位年龄57.9岁。病理类型：腺癌44例，黏液腺癌10例，印戒细胞癌12例。分化程度：高中分化14例，低未分化52例。术后均经病理确诊。根据淋巴结转移情况，将66例胃癌患者标本分为淋巴结转移组（46例）和未转移组（20例）， 均以术后病理为准。

    1.2　组织总RNA提取　采用TRIzol试剂盒（购自Invitrogen公司）一步法提取胃癌组织和癌旁组织总RNA，紫外分光光度计检测RNA 浓度及A260/ A280比值(＞1.6)，调RNA浓度至0.5 μg/μl。

    1.3　BRMS1 mRNA的表达　应用 RT-PCR检测BRMS1 mRNA的表达。RT反应：在20μl反应体系中加5×Buffer 4 μl，0.1 mol/L 二硫苏糖醇（DTT）2 μl（购自Invitrogen 公司），10 mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTPs） 1 μl（购自Fermentas公司），15 nmol/L 寡聚脱氧胸苷酸（OligodT） 1 μl（购自上海博雅技术公司），10 U/μl 鼠类白血病病毒逆转录酶（MMLV） 10 U（购自Invitrogen公司），模板RNA 2 μl（0.5 μg/μl），0.1%焦碳酸乙二脂（DEPC）处理水8 μl，入PCR仪37 ℃反应60 min，95 ℃ 5 min灭活MMLV；PCR反应：在50 μl反应体系中加10×Buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl2 4 μl，10 mmol/L dNTPs 0.5 μl，1 U/μl Taq酶1 μl（购自Fermentas 公司），上、下游引物各1 μl 15 pmol/μl（购自上海博雅技术公司），RT产物cDNA模板3 μl，0.1%DEPC 处理水34.5 μl，入PCR仪。反应条件：94 ℃变性3 min，然后94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，27个循环，最后72 ℃延伸10 min。BRMS1上游引物：5ˊ-GGTTTCTGGCCCATACATC-3ˊ，下游引物：5ˊ-AGCCGTCATCCAACTTCA-3ˊ，扩增片断494 bp。β-actin 上游引物：5ˊ-ACTATGTTTGAGCCTTCAACA-3ˊ，下游引物：5ˊ-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA -3ˊ，扩增片断340 bp。

    1.4　PCR产物半定量分析　取10 μl PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统下分析，将β-actin条带的吸光度值定为10，取目的基因条带与β-actin条带吸光度值的比值作为目的基因的相对值。

    1.5　统计学处理　应用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示,组间的比较采用t检验及方差分析， P≤0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  BRMS1 mRNA在胃癌组织中的表达及其与淋巴结转移的关系 　 转移组的胃癌组织中BRMS1 mRNA的表达为0.405±0.072， 未转移组的胃癌组织中表达为0.525±0.091，淋巴结转移组的表达水平低于未转移组的表达水平 (图1，P＜0.05)。

    2.2　BRMS1 mRNA在胃癌组织中的表达与胃癌病理类型及分化程度的关系　各病理类型之间BRMS1 mRNA的表达无显著性差异（P＞0.05）， 各分化程度之间BRMS1mRNA的表达无显著性差异，P＞0.05（见表1） 。

    3　讨论

    　　2000年Seraj等［１］通过差异显示 的方法比较neo11/435细胞［4］和亲代细胞的基因表达差异，在neo11/435细胞中找到6种表达量比亲代高至少5倍的mRNA。这6种mRNA中，3种为己知基因的同源基因，另外3例是新基因，其中一个新基因被克隆，并定位到11号染色体的11q3.l～11q3.2区域。将稳定转染该基因的具有转移能力的人乳腺癌细胞MDA-MB-435和MDA-MB-231注射入小鼠乳腺脂肪垫（人乳腺的同源器官）时，仍可以形成继续生长并能够发生局部侵袭的肿瘤，但是其转移到肺和淋巴结的能力明显降低，因此该基因被确定为新的癌转移抑制基因，被命名为BRMS1 。

    　　BRMS1基因具有抑制肿瘤细胞远处转移的作用，其转移抑制可能与软琼脂中生长能力下降以及同型缝隙连接的恢复有关，BRMS1基因并不上调NM23、 Kai1、 Kissl、E-cadherin等转移抑制基因的表达。Saunders等［５］研究显示BRMS1基因可促使细胞通讯连接恢复并增加连接蛋白Cx43的表达，降低Cx32的表达，来抑制乳腺癌的转移。BRMS1基因抑制肿瘤转移的机制是复杂的，非典型的，其具体机制仍有待于进一步深入研究。

    　　虽然BRMS1基因首先作为乳腺癌转移抑制基因而发现的，但研究发现BRMS1基因在其他肿瘤转移中也起抑制作用，其抑制作用并不仅仅限于乳腺癌，随肿瘤细胞转移能力的增加，其表达下降或缺失。Shevde等［６］研究发现BRMS1 mRNA在黑色素细胞中高表达，随着细胞侵袭能力的增加，BRMS1 mRNA的表达逐渐下降，在高转移的恶性黑色素瘤细胞中几乎检测不到BRMS1 mRNA的表达。Seraj等［７］比较了T24和T24T两株膀肤癌细胞中BRMS1基因的表达，发现在转移能力更强的T24T细胞中BRMS1 mRNA的表达减少。张殊等［８］报道了BRMS1基因在卵巢上皮癌中的表达，研究发现BRMS1基因在正常卵巢组织、无转移卵巢癌原发灶、有转移卵巢癌原发灶和卵巢癌盆、腹腔转移灶中BRMS1 mRNA的表达水平逐渐下降，呈递减趋势，并证明各组间差异有显著性（P＜0.05）。Stark等［９］研究发现浸润性乳腺癌患者的脑转移病灶中，BRMS1 mRNA的表达水平低于原发灶的表达水平，提示BRMS1基因可能抑制乳腺癌患者的远处转移，将BRMS1 mRNA的表达水平作为选择的指征。

    　　本研究应用分子生物学方法研究BRMS1 mRNA在胃癌中的表达，发现胃癌淋巴结转移组BRMS1 mRNA 的表达水平显著低于未转移组的表达水平 （P＜0.05），BRMS1 mRNA 的表达水平随胃癌淋巴结的转移而下降，BRMS1 mRNA在胃癌组织中的表达水平与淋巴结转移呈负相关，这提示BRMS1 mRNA的表达下降能够促进胃癌淋巴结的转移，可以作为临床预测胃癌转移的指标之一。同时发现，BRMS1 mRNA的表达与胃癌的病理类型和分化程度无关， 提示可以将BRMS1 mRNA的表达水平下降作为判断胃癌患者发生转移的新指标，通过治疗前检测BRMS1 mRNA的表达水平来预测胃癌发生远处转移的可能性，为制定胃癌手术和化疗方案提供指导。

    　　由于转移等恶性表型的获得是多基因、多步骤的遗传学改变结果，所以有必要将BRMS1基因与其他基因如P53，Cerb-B-2等进行同步分析，才能更准确的反映基因与胃癌生物学行为的关系。

【】
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9] Stark AM, Tongers K, Maass N,et al. Reduced metastasis-suppressor gene mRNA expression in breast cancer brain metastases[J]. Cancer Res， 2005,65:713-717.