HSPb1真核表达载体的构建及其在乳腺癌细胞中表达的研究
作者：时鹏 王明明 孙靖中 冯进波
【摘要】 目的：构建重组人 HSPb1 真核表达载体质粒，为研究 HSPb1 与乳腺癌发生和化疗耐药的关系做准备。方法：从人乳腺癌细胞 MCF-7 中提取总 RNA，RT-PCR 法反转录合成 cDNA。设计引物调取目的基因片段，与T载体连接后转化大肠埃希菌 DH-5α，筛选菌落并抽提质粒。测序正确后双酶切克隆进入真核表达载体 pcDNA3.1 中，得到重组质粒 pcDNA3.1-HSPb1。用 pcDNA3.1-HSPb1 转染人乳腺癌细胞 MDA-MA-231,RT-PCR 法和 Western blot 法鉴定重组质粒在其中的表达。结果：经酶切证实重组质粒 pcDNA3.1-HSPb1 含有目的基因 HSPb1。RT-PCR 和 Western blot 检测表明, mRNA 和蛋白水平，转染细胞 HSPb1 的表达均明显增强。结论：pcDNA3.1-HSPb1 真核表达载体构建成功，它在乳腺癌细胞中可高表达目的基因，为进一步研究 HSPb1 在乳腺癌发生及化疗耐药中的作用奠定了基础。
【关键词】 乳腺肿瘤 热休克蛋白质类 因表达 基因重组 克隆 分子
Construction of HSPb1 expression vector and its function in breast cancer cells
【ABSTRACT】 Objective: To construct the eukaryotic expression plasmid of recombinant human heat shock protein b1 （HSPb1） and study its expression in breast cancer cells. Methods: Total RNA was isolated from human breast cancer cells MCF-7, and the full-length coding sequence of HSPb1 was constructed by standard reverse transcriptional PCR method. The fragment was inserted into the shuttle vector T. Transformation of E.coli DH-5α with recombinant plasmids and identification of bacterial colonies containing recombinant plasmids by LB-agar plate containing 100μg/ml of ampicillin were conducted， and recombinant plasmids were extracted and purified. All sequences amplified by PCR were confirmed by complete sequencing. Correct sequences were cloned into the pcDNA3.1 vector. pcDNA3.1-HSPb1 was transfected into breast cancer cell line MDA-MB-231. The HSPb1 expression was detected by RT-PCR and Western blot. Results: Recombinant pcDNA3.1-HSPb1 contained the correct recombinant human HSPb1 sequences. Conclusions: The pcDNA3.1-HSPb1 plasmids might express the target gene in high level.
【KEY WORDS】 Breast neoplasms·Heat-shock protain·Gene expression·Gene rearrangement·Cloning molecular
HSPb1是小分子量热休克蛋白（small heat shock protein，sHSP）亚家族中的重要一员。作为一种应激蛋白，具有保护细胞免受应激因素损伤、维持细胞内稳态的作用。近年来的研究发现它还参与肌动蛋白的聚合和解聚过程［１，２］，影响细胞的增殖、分化及细胞凋亡的信号传导［3-6］。国外报道，HSPb1在乳腺癌和前列腺癌等肿瘤的发生、临床预后及化疗耐药等方面均起一定的作用［7，8］。我科已成功构建乳腺癌转移抑制基因BRMS1真核表达载体［９］，这次我们用分子克隆的方法构建了HSPb1真核表达载体，并检测了其在乳腺癌细胞中的表达，为进一步研究HSPb1与肿瘤的关系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 pcDNA3.1真核表达载体、人乳腺癌细胞系MDA-MB-231由山东大学齐鲁心血管病中心实验室保存，人乳腺癌细胞系MCF-7购自山东省医学院基础研究所，细胞培养RPMI 1640和小牛血清购于Gibco公司，所有工具酶购自Promega 公司，亚克隆载体pMD18T Simple vector（简称Ｔ载体）、DNA片段琼脂糖凝胶回收和小量质粒提取试剂盒、限制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ和T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。脂质体转染试剂盒Lipofectamine TM2000和G418购自Invitrogen公司， HSPb1多克隆抗体和辣根过氧化酶偶联的兔抗羊IgG均购自Santa cruz公司。
1.2 人HSPb1基因的扩增
1.2.1 逆转录 高水平表达HSPb1的MCF-7细胞，培养于含10％ 小牛血清的RPMI 1640培养液中，待90％ 满后，胰酶消化并收集细胞，PBS洗涤2次，Trizol一步法提取细胞总RNA，以Oligo dT（18T）为引物，MMLV催化逆转录反应。
1.2.2 目的基因片段的体外扩增及回收与纯化 根据已知的基因序列设计引物，由上海博亚公司合成。上、下游引物分别为5′-AAGCTTCTG AGCAGACGTCCAGAGCA-3′和5′-GGATCCGCATCCGGGCTAAGGCTTT-3′，其中下划线部分为酶切位点。95 ℃ 变性5 min后，按以下参数进行35次循环：94 ℃变性1 min，58 ℃ 复性1 min，72 ℃ 延伸1.5 min。最后72 ℃ 延伸7 min。琼脂糖凝胶电泳，切胶回收并纯化目的基因片段。
1.3 HSPb1真核表达载体的构建
1.3.1 重组亚克隆载体的构建 回收的目的基因片段16 ℃ 下与Ｔ载体连接2 ｈ，连接后产物转化感受态大肠埃希菌DH-5α，加入LB培养基800 μl，37 ℃摇床培养45 min后，取200 μl涂布LA平板培养基，37 ℃ 过夜培养，筛选阳性克隆菌株，接种至4 ml的LA培养基中并过夜培养，提取并纯化质粒。
1.3.2 目的基因的序列测定 测序工作由Invitrogen公司完成。
1.3.3 目的基因片段克隆进入pcDNA3.1载体 测序正确的目的基因片段-Ｔ载体质粒和pcDNA3.1用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，T4连接酶连接两片段，产物转化感受态大肠埃希菌DH-5α，涂布LA平板培养基，过夜培养菌体。挑选菌落，提取pcDNA3.1 HSPb1质粒。
1.4 质粒转染和阳性细胞克隆的筛选 用Lipofectamine TM2000将pcDNA3.1 HSPb1质粒和pcDNA3.1空质粒转入MDA-MB-231细胞中，G418筛选neo基因阳性克隆。阳性克隆分别命名为H-231和P-231。
1.5 RT-PCR分析 Trizol一步法提取H-231和P-231细胞总RNA，以Oligo dT（18T）为引物逆转录成cDNA。根据基因序列设计检测引物，上游引物为5′-CAAGGATGGCGTGGTGGA-3′，下游引物为5′-TCTCGTTGGACTGCGTGGC-3′，以合成的cDNA为模板，扩增条件为95 ℃ 预变性5 min后，94 ℃、 45 s，58 ℃、 45 s，72 ℃、 45 s，35个循环；最后72 ℃延伸7 min。取10 μL PCR产物行2% 琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色后, Fluor Chem 9900凝胶成像系统观察分析实验结果。
1.6 Western blot分析 H-231和P-231细胞经PBS冲洗后，直接使用裂解缓冲液（2％ SDS，10％甘油，0.15 mol／L Tris-HC1）进行裂解，然后在沸水浴中放置5～10 min。等量蛋白进行SDS-PAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉4 ℃ 封闭过夜，弃溶液，加入5% 脱脂奶粉稀释的抗HSPb1多克隆抗体（1:100稀释），室温轻摇2 h，TBST洗膜3次，加入5% 脱脂奶粉稀释的辣根过氧化酶偶联的兔抗羊IgG（1:2 500稀释），室温轻摇2 h， TBST洗膜3次后，DAB显色5 min，FluorChem 9900凝胶成像系统观察分析实验结果。
2 结果
2.1 重组质粒的酶切鉴定 用HindⅢ和BamHⅠ双酶切重组质粒pcDNA3.1 HSPb1,得到了与预期大小相符的外源基因HSPb1插入片段。HSPb1片段为679 bp,而对照pcDNA3.1经双酶切后无此插入片段（图1）,证实克隆成功。
2.2 重组HSPb1全序列测序分析 DNA测序结果表明,重组质粒pcDNA3.1 HSPb1中插入基因大小为679 bp, 插入方向正确,所获得的重组HSPb1与预期的DNA序列完全相同。
2.3 HSPb1基因在乳腺癌细胞中的表达 将pcDNA3.1空载体及pcDNA3.1 HSPb1重组质粒转染MDA-MB-231细胞,收集阳性克隆细胞。RT-PCR结果显示H-231细胞中HSPb1的mRNA表达水平明显高于P-231细胞（图2）。Western blot检测结果显示，转染H-231细胞表达了相对分子质量约为27×103的HSPb1蛋白,与P-231细胞相比，HSPb1蛋白表达水平明显提高（图3）。
3 讨论
热休克蛋白（heat shock protein， HSP） 又称应激蛋白（stress protein, SP）,是机体细胞在应激原诱导下,高效表达的一组蛋白质。HSP在体内可与多种蛋白形成复合体,发挥其“分子伴侣”的作用。根据相对分子质量的大小，HSP家族可以分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和相对分子质量为30×103左右的sHSP等5个亚家族。HSPb1是sHSP亚家族中的重要一员，由205个氨基酸组成，其中第15、78和82位是丝氨酸,具有保守性，是HSPb1发生磷酸化的主要位点。在生理条件下，HSPb1主要以寡聚体的形式存在于细胞质中,应激时HSPb1发生磷酸化，并迅速进入细胞核和核仁内,发挥其“分子伴侣”的功能［10］。HSPb1的磷酸化状态、细胞内定位和寡聚化水平都影响其生物学功能。
HSPb1首先在人乳腺癌细胞系MCF-7中发现，是一种雌激素受体相关蛋白［１１，１２］。研究发现HSPb1能引起乳腺癌细胞产生化疗耐药，在热休克后，人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中HSPb1的表达水平升高，同时对表柔比星产生耐药，但对顺铂、5-Fu、甲氨喋呤和秋水仙碱的敏感性未发生改变［１３，１４］。因而，对乳腺癌患者来说，HSPb1是一个不良的预后因素。Oesterreich 等［１5］采用免疫组织化学方法检测了788例乳腺癌患者中HSPb1的表达，发现其表达水平与雌激素受体和孕激素受体的表达及染色体异倍体率正相关，与肿瘤大小和S期比例无关；HSPb1表达水平不影响乳腺癌患者的无瘤生存率和总体生存率，但在雌激素受体阳性和需要接受放、化疗的患者中，HSPb1高表达者无瘤生存期短。近年来，人们还发现HSPb1参与了乳腺癌的发生。O’Neill等［７］研究了HSPb1在乳腺正常上皮、增生上皮和原位癌组织中的表达，发现其表达水平逐渐升高，分别为7.4％、25.17％和61.1％，HSPb1表达水平的升高在乳腺癌发生的早期就已出现，这可能是促进肿瘤发生的一个重要因素；而且，在乳腺良性病变及乳腺癌标本中HSPb1与雌激素受体α的表达明显相关，说明HSPb1的表达升高可能是激素依赖性乳腺癌发生途径中的一个环节。 本实验成功地构建了pcDNA3.1 HSPb1真核表达载体。为进一步研究HSPb1在乳腺癌发生和过程中的作用及其诱导化疗耐药机制奠定了基础。
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