凋亡抑制蛋白XIAP与肿瘤多药耐药
【摘要】 XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis protein）是凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis protein，IAP）家族中最有效的内源性凋亡抑制因子，可以通过直接抑制caspases或者参与信号转导途径抑制细胞凋亡。研究发现，XIAP与肿瘤多药耐药有密切关系，并且有可能成为逆转肿瘤多药耐药提高化疗效果的新靶点。
【关键词】 XIAP 细胞凋亡 抗药性 多药
凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis protein，IAPs）是细胞内一类重要的凋亡抑制因子，包括XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis protein）、Hiap-1、Hiap-2、NAIP、Survivin、apollon和livin等，与其他可抑制上游caspases的蛋白不同，IAPs是惟一的内源性caspases抑制物。在IAP家族中，XIAP是最有效的内源性caspases抑制因子［1］，可以直接抑制caspases并参与其他的细胞功能活动，例如调节受体介导的信号转导和蛋白泛素化等，能够通过多种途径调节细胞凋亡。许多研究表明，XIAP与以诱发细胞凋亡为主的肿瘤多药耐药（multi-drug resistance，MDR）密切相关，并且有可能成为提高肿瘤化疗效果的治疗新靶点。
1 XIAP的结构、表达及调节
XIAP又称作MIHA/hILP/BIRC4，基因定位于Xq25。XIAP含有3个BIR（baculovirus IAP repeat）结构域和1个RING锌指结构域。BIR结构域位于XIAP的N末端，是含有3个保守的半胱氨酸和1个保守的组氨酸序列的锌结合结构域，是IAP家族抑制caspases活性、发挥抗凋亡作用必不可少的结构。RING锌指结构域，位于XIAP的Ｃ末端,有E3泛素连接酶活性，能催化自身及靶蛋白通过泛素化而降解，是IAP家族分子另一特征性结构域,也是IAP家族抗凋亡重要的结构。
XIAP广泛表达于大多数成年及胚胎组织中，其mRNA全长约9 kb，其中5′和3′非翻译区（untranslated regions,UTRs）分别长为1.5 kb和6 kb，这种长的UTRs有可能干扰有效的翻译。5′UTR的IRES（internal ribosome entry sequence）可以促使mRNAs在不利的应激条件下（如病毒感染、生长因子去除、低氧、γ照射等）被翻译表达［2］。因此，IRES可能是促使XIAP的mRNA有效翻译表达的一个重要机制，能够显著保护细胞，避免凋亡。
XIAP的负性调节蛋白有XAF1（XIAP associated factor 1）和Smac/DIABLO（second mitochondrial activator of caspases/direct IAPbinding protein with low pI）等。XAF1定位于细胞核,过表达的XAF1能促进XIAP从细胞质向核移位，并结合XIAP拮抗其对caspases的抑制，中和XIAP抗凋亡的能力。Smac/DIABLO定位于线粒体，在凋亡信号刺激后释放，并与XIAP的BIR3结合，抑制XIAP与caspases的结合。丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2在收到凋亡信号后也可从线粒体释放入胞质，降解XIAP等IAP家族成员，这可能是Omi/HtrA2激活caspases诱导凋亡的一个机制。
2 XIAP的抗凋亡途径
XIAP在肿瘤中的抗凋亡作用已被大量实验所证实，它对凋亡的拮抗主要是通过以下几种途径来实现。
2.1 通过抑制caspases拮抗凋亡 XIAP分子可以直接结合和抑制启动性的caspase-9和效应性的caspase-3和caspase-7，但是不能抑制caspase-1、caspase-6、caspase-8和caspase-10。这种对caspases选择性是由BIR结构域上保守氨基酸残基和BIR区间连接区linker的特点决定的。BIR1和BIR2间的连接区linker能与caspase-3及caspase-7的活性中心结合，竞争性抑制两者的活性，BIR2区能够稳定XIAP-caspase复合物。XIAP的BIR3可结合caspase-9形成异源二聚体，使之丧失催化活性。
在被诱导发生凋亡的细胞中发现XIAP蛋白被切割为两个片段［３］，Ｎ端部分含有BIR1-Linker-BIR2结构域，能够拮抗Fas诱导的凋亡，但是这种作用不如完整的XIAP蛋白有效，而C端含BIR3和RING锌指结构的片段没有抗Fas诱导的凋亡的能力，但是可以几乎完全拮抗Bax诱导的凋亡。XIAP的蛋白酶切也许可以更好的调节抑制细胞凋亡的作用范围，以适应各种不同的凋亡刺激。
蛋白降解是细胞发挥正常功能、维持正常的细胞周期、激活转录因子、去除损伤和错误折叠的蛋白的必要环节。被降解的蛋白需与泛素分子耦连,这个过程由泛素激活酶Ｅ1、偶联酶Ｅ2和泛素连接酶Ｅ3等参与。XIAP具有RING锌指结构介导的Ｅ3泛素连接酶活性，能催化自身泛素化和其靶分子的泛素化降解过程。因此XIAP还可以特异性靶向caspases，使其被泛素化降解，保护细胞避免凋亡。而RING区的突变可使E3连接酶活性丧失，使XIAP不能发生自体泛素化降解，抑制了细胞凋亡。
2.2 通过参与信号转导途径抑制凋亡 XIAP是一种多功能生物分子,能参与受体介导的信号转导。XIAP的BIR区介导了和BMP（bone morphogenic protein）的作用，并通过RING锌指结构和BMP受体相互作用。这种相互作用能够介导下游信号分子TAB1（属MAPKKK成员）的活化，这是其他IAPs家族蛋白所无法代替的。活化的TAB1可激活TAK1（TGF-β activated kinase 1）信号途径。这表明XIAP可作为一种TAB1-TAK1的接头蛋白。
XIAP还可选择性激活MAPK信号途径另一个激酶JNK1（c-jun N-terminal kinase 1），这种作用依赖BIR结构和BIR间的连接区。XIAP和BMP受体结合后,激活了TAB1-TAK1-JNK1级联反应途径,这可能介导了对caspase-1诱导凋亡的抑制。
当有外界刺激时，XIAP等的表达能诱导NF-κB的活化，保护细胞免受炎症因子TNFα，IL-1β，LPS等介导的细胞凋亡［4］。此外， XIAP与细胞存活激酶途径PI3K（phosphoinositide 3 kinase）/Akt的相互作用也是促使细胞逃避凋亡的机制之一［５］。
3 XIAP与肿瘤多药耐药的关系
肿瘤产生的耐药性是肿瘤术后化疗失败的只要原因之一［6］。肿瘤多药耐药，即一种药物作用于肿瘤使之产生耐药性后，该肿瘤同时对另一些未接触过的、化学结构无关、作用机制完全不同的多种抗肿瘤药物也产生交叉耐药性的现象。大量研究表明诱导细胞凋亡是许多化学结构不同、作用靶点各异的化疗药物杀伤肿瘤细胞的共同通路。XIAP的表达和活性异常可能作用于肿瘤细胞拮抗化疗药物诱导的凋亡，因此，肿瘤细胞通过逃逸凋亡或拮抗凋亡获得生存这一途径，或许对于解释肿瘤MDR更具有普遍意义［7］。
研究发现，过表达高半胱氨酸蛋白61（cysteina rich 61，Cyr61）的乳腺癌MCF-7细胞能拮抗紫杉醇、表柔比星以及beta-lapachone等多种药物诱导的凋亡，其中XIAP的mRNA及蛋白均有明显的增加，而使用XIAP反义寡核苷酸治疗后，XIAP水平下调能够明显逆转该细胞对多种药物诱导凋亡的拮抗［8］。在移行细胞癌细胞中也发现升高的XIAP是发生多药耐药的一个重要因素［9］。Mansouri等［10］、Sasaki等［１1］发现XIAP可能是决定卵巢癌的化疗敏感性的关键因素。黑色素瘤是最富侵袭性的皮肤癌,对多种抗癌药物高度耐药，在其中也观察到XIAP的广泛表达［１2］，研究发现XIAP能够保护黑素瘤细胞避免肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF－related apoptosis－inducing ligand，TRAIL）介导的凋亡［１3］。对比研究人HL-60细胞系和它的多药耐药变异株HL-60R细胞系，发现HL-60R中XIAP的mRNAs和蛋白显著过表达[14]。Campone等[15]用亚致死剂量的表柔比星持续作用于HL-60细胞，使之发生获得性化学耐药,能同时耐受P-gp和非P-gp作用物介导的凋亡，而这种对凋亡的拮抗证明是源于诱导了细胞内XIAP的表达。这些结果均证明XIAP的表达和活性异常的确对肿瘤细胞的多药耐药的产生有明显影响。
4 通过抑制XIAP逆转肿瘤多药耐药
细胞中过表达的XIAP导致了对凋亡的抑制，这在肿瘤化疗发生多药耐药中起着重要作用，特异性XIAP抑制剂可使肿瘤细胞的凋亡增加，逆转肿瘤对化疗药物的耐药性。从理论上说，可以从不同的生物学水平实现对XIAP表达的抑制。
4.1 在核酸水平抑制XIAP 反义技术、RNA干扰技术等都是通过不同的方式把与XIAP的mRNA互补的DNA或RNA小分子导入恶性肿瘤细胞，以抑制其蛋白翻译，诱导其mRNA分子的降解。
以腺病毒为媒介转导反义XIAP，能够降低XIAP蛋白的水平，增加细胞对化疗药物诱导的凋亡的敏感性［11-14］。但是由于这种方法有感染的风险，在临床上的应用受到限制。相比而言，反义寡核苷酸更安全更易于使用。在对不同细胞系的研究中（膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞性肺癌、急性髓细胞性白血病、前列腺癌等），均发现XIAP反义寡核苷酸的使用下调了XIAP的mRNA水平，导致细胞对几种常用化疗药的耐药性明显降低［16-19］。可见反义核酸技术在逆转肿瘤多药耐药的应用中有着很好的前景。
双链RNA在体内被加工成19～23 bp大小的片段，这些片段被称为小片段干扰RNA（siRNA）， 并与许多胞内RNA诱导沉默复合物（RISC）蛋白，在siRNA 的指导下，RISC可以识别并降解目的mRNA，高效、特异地阻断体内特定基因表达［20］。研究发现，siRNAs可以阻断XIAP对药物诱导凋亡的抵抗，增加细胞凋亡，在逆转人乳腺癌MCF-7细胞以及人胶质瘤细胞的化疗耐药中起到重要作用［21，22］。因此，siRNAs可能会是逆转多药耐药的有力工具。
另外，5′端的IRES序列能够促使XIAP的mRNA在各种应激如放疗和化疗中有效的翻译表达以拮抗凋亡，这使其也成为一个有吸引力的治疗靶点。
4.2 调节或阻断XIAP蛋白的功能 抑制XIAP蛋白的功能，通常是设计适当的小分子，使其能够特异性连接靶蛋白，抑制其生物学功能。一种途径是在XIAP高表达的肿瘤细胞中使用单克隆抗体，干扰XIAP的抗凋亡作用，从而诱导凋亡。另一种途径是利用XIAP的负性调节因子，如XAF1、Smac以及Omi等，抑制XIAP的表达，诱导凋亡，逆转肿瘤的化疗耐药。研究发现，当用XAF1阻断XIAP的活性时，XIAP的表达下调，显著增强了肿瘤细胞的凋亡，改善了其对化疗药物的低敏感性［２3］。Smac也能够拮抗XIAP，降低细胞对化疗药物的耐药性。近来发现的新的XIAP小分子拮抗剂，结构类似于Smac，含有与Smac N末端残基处相同的AVPI序列，能够通过氢键与XIAP的Bir3结构域结合，抑制XIAP表达，诱导细胞凋亡，可能对于由于XIAP过表达而抵抗药物诱导凋亡的癌症有重要作用［２4］。但是，应用于临床前，必须对其蛋白水解的稳定性、细胞通透性和药动学等方面做进一步的改进。
当前，一种新途径引起了更多关注，即使用组合化学文库挑选能够作为XIAP拮抗剂的药小分子。有研究发现一种广谱抗肿瘤活性的小分子，能够逆转XIAP介导的对caspase 3的抑制作用，增加肿瘤细胞对化疗的敏感性［２5］。
此外，XIAP作为NF-kappaB的激活目的基因之一，能被NF-kappa B的抑制剂I-kappa B所抑制。在hl60的多药耐药变异株HL-60R中，发现抑制NF-kappa B可能是阻断XIAP上调的有效的方法，改善了细胞对药物诱导凋亡的拮抗［１4］。而在乳腺癌MCF-7细胞使用DN-Ikappa B阻断NF-kappa B活性也能有效的降低升高的XIAP水平，逆转细胞对多种药物诱导凋亡的不敏感［8］。因此，这也是一个值得尝试的抑制XIAP逆转MDR的方向。
5 结语
XIAP介导的凋亡抑制可能是肿瘤细胞发生MDR的一种机制，同时也提示XIAP基因及其表达产物可能成为逆转肿瘤细胞MDR、提高化疗效果的新靶点。尽管许多化合物具有体外逆转MDR，的作用，但是在临床应用中,未能取得满意结果。多药耐药是目前肿瘤治疗中的一个难题，逆转肿瘤多药耐药，尚需进一步的研究和探索。
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