消炎液对肢体动脉缺血性疾病治疗作用的实验研究

             作者：辛绍伟　金星　梁勇　侯向前　许浩  

【摘要】  　　目的：通过动物实验观察消炎液对肢体动脉缺血性疾病的作用。方法：造模成功后，将30只大白鼠随机分为空白对照组、生理盐水组和消炎液治疗组，每组10只，分别给予不同的处理，于第21天处死动物取标本进行病理检查、检测VEGF水平以及平均血管密度。结果：消炎液组与对照组比较，肢端坏疽、感染范围明显减小，同时患肢跛行和肿胀减轻，且消炎液组VEGF和FⅧ相关抗原的表达水平高于对照组（P＜0.05）。 结论：消炎液可以有效的防止坏疽肢端和缺血肢体的局部组织坏死液化后继发感染，在一定程度上缓解肢体疼痛；并促进患肢侧支循环的建立，从而减少截肢的范围。

【关键词】  大鼠·血液供给·缺血·丹参·黄连

　　 Experimental research of antiphlogistic liquid used in hind limb ischemia rats

        【ABSTRACT】 Objective: To research the effect of Antiphlogistic Liquid used in Hind Limb Ischemia rats, and to approach the mechanism. Methods: 30 rats were divided into three groups: blank groups（10）、NS groups（10） and Antiphlogistic Liquid groups（10）. Different treatment were provideed. On 7th day、14th day and 21th day after the operation, the limbs were observed. After 21 days, sacrificed all rats, took the organization specimen.The expression of VEGF in protein level and average blood vessel densities were identified. Results: After Antiphlogistic Liquid was used, the ambit of gangrene and the infection was decreased. At the same time the limp and swelling was relieved. What's more, accompanied with the VEGF and FⅧ related antigen expression increament, the collateral circulation was established. Conclusion: Antiphlogistic Liquid can effectively prevent the the gangrene and the local tissue of the ischemia limb from seconddory infecton, and realeasethe ache of the affected limbs. In a way, the Antiphlogistic Liquid can release the ache of the attected limb and  prompt the establishement of the compensatory circulation. As a reault the Antiphlogistic Liquid can diminish the extent of amputated extremity

    　　近年来，下肢动脉缺血性疾病的发病率有上升趋势，而且是引起肢体坏疽导致下肢截肢的主要原因之一［1］。如何降低下肢缺血性疾病的截肢率，改善患者的生活质量，已成为血管外科面临的重要问题。我院多年来应用自行配制的中药药液（消炎液）外用于患者的坏疽肢端和缺血肢体的局部，经临床观察，该药液可以有效的防止坏疽肢端和缺血肢体的局部组织坏死液化后的继发感染，在一定程度上缓解肢体的疼痛，还有促进局部建立侧支循环的作用，从而可以降低截肢平面。本研究通过动物实验进一步证实了“消炎液”的作用。

    １　材料与方法

    1.1　实验动物与分组　Wistar大白鼠30只（由山东大学医学院实验动物中心提供），雄性，体质量300～400 g，随机分为3组，每组10只。A组：空白对照组。B组：生理盐水组。C组：消炎液治疗组。

    1.2　消炎液配方　黄连30 g，丹皮12 g，丹参30 g，苦参30 g，黄柏15 g，防风12 g，白芷15 g。

    1.3　相关试剂　VEGF一抗（小鼠多抗，产品编号：SC-7269，Santa Cruz Biotechnology生产,购于北京中杉金桥生物技术有限公司）、兔抗人FⅧ抗体（购于北京中山生物有限公司）、生物素化二抗工作液（过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒：山羊多抗，通用型SP Kit工作液，产品编号：SP-9002，北京中杉金桥生物技术有限公司提供）。

    1.4　实验方法　A组暴露大鼠后肢股动脉，但是不对股动脉处理。B组、C组在显微镜下行大鼠后肢股动脉穿刺，注入月桂酸0.2 ml（浓度为10 mg/ml）,制造出大鼠后肢缺血的模型［2］。C组每日用消炎液浸泡造模侧下肢2次，每次15 min，早晚各1次。A、B组每日用生理盐水浸泡造模侧下肢2次，每次15 min，早晚各1次。

    1.5　观察指标与检测　造模成功后，严密观察各组动物患肢的病情变化，观察指标为大鼠后肢的皮色、皮温，动脉搏动情况，患肢有无跛行、肿胀、继发感染及坏疽。第21天处死动物，留取标本，进行HE染色，免疫组织化学SABC法检测VEGF和FⅧ相关抗原的表达情况。肌肉细胞内出现棕黄色颗粒为阳性，利用免疫组化图像分析系统进行图像分析，每例选5张组织切片，于低倍镜下找出5个着色最深的区域（热点）,再将这些区域逐个进行数字图像处理，测出积分光密度，然后取其平均值对所获数据进行统计学处理。

    1.6　统计学处理　两组间进行两样本的t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

    ２　结果

    2.1　动物模型观察　A组：10只大鼠在观察期间，均无下肢缺血的表现。B组：10只大鼠在观察期间，出现大鼠造模侧后肢足爪部苍白2只，跛行和拖曳现象2只，坏疽和木乃伊化3只，后肢坏疽部分脱落伴不同程度感染3只。C组：10只大鼠在观察期间，出现大鼠造模侧后肢足爪部苍白4只，跛行和拖曳现象3只，坏疽和木乃伊化2只，后肢坏疽部分脱落伴不同程度感染1只。

    2.2　VEGF免疫组织化学检测结果　A组大鼠后肢内收肌标本中未检测到VEGF蛋白的表达。B组大鼠造模侧后肢内收肌标本检测到VEGF蛋白的表达，于肌肉组织内,呈棕黄色,周围可见复染的深蓝色细胞核。C组大鼠造模侧后肢内收肌标本VEGF阳性表达高于生理盐水组大鼠造模侧后肢内收肌标本VEGF阳性表达，分别为（6719.61±323.84）和（6345.96±406.50）。经两组间的t检验分析，P＜0.05，差异有统计学意义。

    2.3　平均血管密度（MVD）　免疫组织化学毛细血管染色在镜下观察，A组标本MVD平均为（4±1.12）个/200倍视野，B组标本MVD平均为（2±1.20）个/200倍视野，C组标本MVD平均为（5±1.19）个/200倍视野，即消炎液组的毛细血管密度明显高于生理盐水组（图1）。

    ３　讨论

    　　伴随由动脉粥样硬化引起的下肢动脉缺血性疾病（arteriosclerosis obliterans, ASO）发病率逐渐增多，ASO已成为下肢缺血性坏疽致截肢的主要原因之一。糖尿病性血管病变导致的糖尿病性肢端坏疽是糖尿病的严重并发症之一，近年来，随着饮食习惯的改变，糖尿病患病率有增高趋势，糖尿病性下肢动脉缺血，肢端坏疽也成为下肢截肢的重要因素。此外，血栓闭塞性脉管炎（thromboangitis obliterans, TAO）是导致青壮年患者截肢的最常见血管疾病，动脉栓塞亦是肢体坏死、截肢的一个重要原因［2］。

    　　各方面的研究围绕改善肢体缺血症状，挽救肢体，避免肢端坏疽造成的截肢。在治疗上有药物治疗、手术治疗、介入治疗、基因治疗和干细胞移植等［3］。但是，对于已经发生了坏疽的肢体坏疽肢端和缺血肢体的局部处理，需要进一步研究。坏疽肢端和缺血肢体的局部由于缺血容易继发感染，一旦感染，又影响进一步的治疗。朱长庚［4］、王军等［5］曾报道，指（趾）端缺血通过中药浸泡可以减少坏死。我院近年来应用自行配制的中药药液外用于患者的坏疽肢端和缺血肢体的局部，经临床观察，该药液可以有效的防止坏疽肢端和缺血肢体的局部组织坏死液化后继发感染，在一定程度上缓解肢体的疼痛，促进局部建立侧支循环，从而减少截肢的范围。在该药的使用过程中尚未发现副作用。

    　　通过动物实验，进一步证实了“消炎液”的作用，初步揭示了其作用机制。从动物模型各组间的患肢病情变化，大体标本观察、比较和统计分析可以证实，“消炎液”有防止肢端坏疽和缺血肢体的局部组织坏死液化后继发感染，缓解患肢的症状的作用。同时通过VEGF和FⅧ相关抗原抗体的免疫组织化学检测，从蛋白水平了解了“消炎液”通过促进患肢局部侧支循环的建立发挥上述作用［6］。VEGF和FⅧ相关抗原抗体的表达是反映“消炎液”是否有促进侧支循环建立的客观有力的指标。研究结果证实“消炎液”是一种处理坏疽肢端和缺血肢体局部的有效药物，可以在临床上推广使用。

【】
  [1] 向志，时德，戴远斌.下肢缺血性疾病导致的截肢[J]. 重庆医科大学学报，2001，26 （2）:187-188.

[2] 周青，贺菊乔，曹晖，等.脉管通胶囊对血栓闭塞性脉管炎大鼠模型影响的研究[J]. 湖南中医学院学报, 2003，23（4）：4-6.

[3] Ikehara S. A novel strategy for allogeneic stem cell transplantation: perfusion method plus intra- bone marrow injection of stem cells[J]. Exp Hematol, 2003,31（12）:1142-1146 .

[4] 朱长庚.指（趾）端缺血通过中药浸泡减少坏死的临床观察：附16例病例[J]. 陕西中医学院学报，1994,17（2）：47.

[5] 王军，王玉升，付蔓华，等. 脉络通冲剂抗血栓闭塞性脉管炎的实验研究[Ｊ].中西医结合杂志,1996,16（7）：421-423.