乳腺浸润性导管癌组织中PTTG及COX2的表达及临床意义
作者：夏丹 张庆慧 许复郁 张翠娟 季昌华
【摘要】 目的：检测乳腺浸润性导管癌组织中垂体肿瘤转化基因（pituitary tumor-transforming gene, PTTG）和环氧化酶2（cyclooxygenase-2, COX2）的蛋白表达水平并分析与其他临床病理特征的关系。方法:用免疫组织化学Evinson法检测104例乳腺浸润性导管癌组织中PTTG和COX2的蛋白表达水平。结果:104例乳腺浸润性导管癌组织中，有95例检测到PTTG阳性表达，阳性率为91%，其中41例呈低表达（39%），54例呈高表达（52%）。104例乳腺浸润性导管癌组织中，有 70例检测到COX2阳性表达，阳性率为 67%，其中53例呈低表达（51%），17例呈高表达（16%）；PTTG表达与肿瘤大小、组织学分级密切相关，组织学分级越高，PTTG 表达越强，PTTG 表达与年龄、淋巴结转移、ER、PR和HER2状态无关；COX2表达与ER表达、肿瘤大小、组织学分级和淋巴结转移相关，ER（+）组的COX2表达高于 ER（-）组，COX2表达与 PTTG 表达、年龄、PR和HER2 状态无关。结论: PTTG和COX2在乳腺浸润性导管癌组织中的表达可能促进乳腺浸润性导管癌的发生,并且与低分化、预后不良有关。COX2可能通过刺激雌激素合成来促进乳腺癌细胞增殖。COX2可能促进乳腺癌侵袭转移。
【关键词】 乳腺肿瘤·垂体肿瘤转化基因·环氧化酶·免疫组织化学
Expression of PTTG and COX2 in breast invasive ductal carcinoma and their clinical significance
【ABSTRACT】 Objective: To evaluate the expressions of PTTG and COX2 in breast invasive ductal carcinoma and their clinical significance. Methods: The expressions of PTTG and COX2 were examined in 104 patients with breast invasive duct carcinoma using Evinson techniques. Results: The positive rates of PTTG and COX2 expressions were 91％ and 67％ respectively. There were significant associations between PTTG expression and histological grade and tumor size. There were nosignificant associations between PTTG expression and age, lymph node metastasis, ER, PR, HER2 state. The expressions of COX2 had correlation with ER state, tumor size, histological grade, lymph node metastasis. There were no significant associations between COX2 expressions and PTTG expression and age, PR, HER2 state. Conclusion: The expression of PTTG was possibly involved in the development of breast cancer, and had correlations with low differentiation degree and bad prognosis. COX2 might promote breast cancer proliferation of cells by stimulating estrogen combining.
【KEY WORDS】 Breast neoplasm·PTTG·COX2
垂体瘤转化基因（pituitary tumor-transforming gene, PTTG）在许多肿瘤组织中高表达，参与多种肿瘤发生发展全过程，引起国内外学者的关注。环氧化酶（cyclooxygenase-2, COX2）是花生四烯酸代谢成为前列腺素的限速酶，在炎症、肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用。我们用免疫组化法检测PTTG和COX2在乳腺癌组织中的表达，探讨其在乳腺癌组织中表达的意义。
1 材料与方法
1.1 标本 取自山东大学第二附属2002年1 月～2005年12月乳腺手术切除的肿瘤组织及距切缘5 cm经病理证实的正常组织。术后组织用 4% 甲醛固定，石蜡包埋。104例患者有1例为男性，其余均为女性，年龄29～75岁，中位年龄49岁。
1.2 试剂 即用型ER、PR、HER2单克隆抗体均为迈新公司产品。PTTG、COX2一抗、鼠兔通用二步法二抗PV 6000和DAB显色剂均购于北京中杉金桥公司。
1.3 检测方法 组织常规4%甲醛固定，石蜡包埋， 4 μm厚连续切片分别用于HE及免疫组织化学。免疫组织化学染色步骤：1）二甲苯脱蜡、梯度酒精水化,采用枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）进行微波热修复20 min,冷却至室温， PBS冲洗3次 ,每次5 min，0.3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶10 min，PBS冲洗3次，每次5 min，分别滴加PTTG、COX2、ER、PR、HER2一抗，4 ℃过夜。2）复温1 h, PBS冲洗3次 ,每次5 min，滴加二抗，2 h行DAB 显色,显微镜观察5～10 min。3）蒸馏水冲洗，苏木精复染，自来水冲洗2 h，梯度酒精干燥，二甲苯透明，中性树脂封固。设立阴性、阳性对照。
1.4 结果判定 ER和PR均为细胞核着色，细胞核呈棕黄色颗粒状着色定为阳性细胞。COX2和 HER2主要为细胞膜着色，部分COX2 细胞质着色。PTTG主要为细胞质着色，部分细胞同时存在核染色。肿瘤组织染色结果判定标准：1）根据染色细胞计数。随机观察5个高倍视野，计数500个细胞中阳性细胞所占百分比，分为5级： 0分，染色细胞<5%；1分，染色细胞5%～25%；2分，染色细胞25%～50%；3分，染色细胞50%～75%；4分，染色细胞﹥75%。2）根据染色强度分为4级：0分，不着色；1 分，浅黄色；2分，棕黄色；3分，深棕色。每份切片记分=染色细胞数分数+染色强度分数。所得分数≤1分为阴性结果，2～3分为（+），4～5分为（++），6～7分为（+++） 。（+）计为低表达，（++）和（+++） 计为高表达。
1.5 统计学处理 采用SPSS14.0统计软件包进行处理， χ2 检验，P≤0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PTTG 在浸润性乳腺癌组织中的表达 104 例乳腺浸润性导管癌组织中，95 例检测到 PTTG 阳性表达（91%），其中 41 例呈低表达（39%），54 例呈高表达（52%），见表 1。PTTG 大部分表达在胞质,部分同时在胞核中表达。呈散在表达，异形性大的肿瘤细胞，核分裂的细胞等增殖活跃细胞多呈阳性表达（图1）。
2.2 COX2在浸润性乳腺癌中的表达 104例乳腺浸润性导管癌组织中，有70例检测到COX2阳性表达（67%），其中53例呈低表达（51%），17例呈高表达（16%）（见表1）。COX2大部分为胞膜着色，少部分胞质着色。肿瘤细胞着色，间质细胞不着色（见图1）。
2.3 PTTG、COX2与其它病理特征的关系 PTTG表达与肿瘤大小、组织学分级密切相关（P﹤0.005），组织学分级越高，PTTG 表达越强，PTTG 表达与年龄、淋巴结转移、ER、PR和HER2 状态无关（P﹥0.05）；COX2 表达与 ER 表达、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移相关（P﹤0.005），ER（+）组的COX2表达高于ER（-）组，COX2 表达与 PTTG 表达、年龄、PR和HER2状态无关（P﹥0.05）。见表2。
3 讨论
PTTG是一种原癌基因，1997年首次由Pei等［1］从大鼠垂体肿瘤中克隆并命名为垂体肿瘤转化基因。该基因位于5号染色体长臂 5q33 处，全长超过10 ｋb，含5个外显子和 4个内含子。人PTTG编码一个含202个氨基酸残基，相对分子质量约为22×103的蛋白质。PTTG的三个同系物已经被证实（PTTG1、PTTG2和PTTG3），至今只有 PTTG1（PTTG）被深入研究［２-5］。在大多数正常人体组织，如结肠、大脑、肝脏、胰腺、垂体、肾脏和卵巢等，PTTG 只有弱表达，而在胚胎肝、睾丸和胸腺等含高增殖活性细胞的正常组织中有高表达；在所有的被研究的肿瘤（包括肺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤和结肠癌等）细胞和肿瘤细胞系（包括淋巴细胞系、骨髓细胞系和上皮细胞系等）中都有高表达［6-9］。这与本研究结果PTTG在浸润性乳腺癌组织中表达的阳性率一致。
PTTG阳性染色主要位于胞质，有些位于胞核。PTTG核移位是通过与PTTG结合因子相互作用［10］或者MAPK级联激活［11］所引发。PTTG表达水平在快速增殖细胞中升高，并且以细胞周期依赖方式被调节。PTTG蛋白在G1/S间期表达低，在S期表达逐渐升高，在G2/M期表达水平最高［12］。与本研究结果 PTTG大部分表达在胞质,部分同时在胞核中表达，异形性大的肿瘤细胞，核分裂的细胞等增殖活跃细胞多呈阳性表达相一致。
COX2被认为是“快速反应基因”，静息时并不表达,仅在细胞受到刺激时迅速合成，参与多种病理生理过程，包括炎症过程及肿瘤的发生与发展。
COX2促使肿瘤发生与的机制可能有以下方面［13-15］：1）COX2通过过氧化反应，可以使环境及食物中的多种前致癌物活化为致癌物，这些致癌物可以直接激活癌基因或引起p53等抑癌基因突变。2）COX2催化产生的PGE2是一种较强的免疫抑制剂，从而抑制机体对肿瘤细胞的免疫监视作用，有利于肿瘤细胞的免疫逃逸。３）COX2催化产生过多的前列腺素可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、刺激肿瘤新生血管形成。４）COX2可能参与炎症致癌，长期的慢性炎症是上皮癌变的危险因素之一。５）COX2高表达可上调基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达和活性，使肿瘤细胞具有侵袭性；COX2 高表达还可以导致细胞黏附因子E-Cadherin的缺失，E-Cadherin是一种浸润抑制因子，其缺失有利于肿瘤细胞侵袭转移。本研究结果中COX2表达与肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移相关，提示COX2可能促进乳腺癌侵袭转移。
芳香化酶是雌激素合成的关键酶,其基因 CYP19通过cAMP通路调节其表达,而COX2催化产物 PGE2 可通过增加细胞内cAMP水平来刺激雌激素合成,从而进一步通过雌激素-受体复合物来促进乳腺癌细胞的增殖［16］。本研究结果显示 ER（+）组的COX2表达高于 ER（-）组,说明COX2可能通过刺激雌激素合成来促进乳腺癌细胞增殖。
综上所述，PTTG和COX2在乳腺浸润性导管癌组织中的过表达可能促进乳腺浸润性导管癌的发生与发展,并且与低分化、预后不良有关。COX2 可能通过刺激雌激素合成来促进乳腺癌细胞增殖，并且可能促进乳腺癌侵袭转移。有研究显示，转染了反义PTTG的肿瘤细胞,其PTTG的表达明显下降，因而PTTG可能成为肿瘤基因的新靶点［17］。 COX2抑制剂在乳腺癌的防治中也有良好的前景。
【】
[1] Pei L, Melmed S. Isolation and characterization of a pituitary tumor-transforming gene（PTTG）[J]. Mol Endocrinol, 1997,11（4）:433-441.
[2] Kakar SS. Molecular cloning, genomic organization, and identification of the promoter for the human pituitary tumor transforming gene（PTTG）[J]. Gene, 1999,240（2）:317-324.
[3] Pei L. Genomic organization and identification of an enhancer element containing binding sites for multiple proteins in rat pituitary tumor-transforming gene[J]. J Biol Chem, 1998,273（9）:5219-5225.
[4] Zhang X, Horwitz GA, Prezant TR, et al. Structure, expression, and function of human pituitary tumor-transforming gene（PTTG）[J].Mol Endocrinol, 1999,13（1）:156-166.
[5] Lee IA, Seong C, Choe IS. Cloning and expression of human cDNA encoding human homologue of pituitary tumor transforming gene[J].Biochem Mol Biol Int, 1999,47（5）:891-897.
[6] Dominguez A, Ramos-Morales F, Romero F, et al. hPTTG, a human homologue of rat PTTG is overexpressed in hematopoietic neoplasms.Evidence for a transcriptional activation function of hPTTG[J].Oncogene, 1998,17（17）:2187-2193.
[7] Zhang X, Horwitz GA, Heaney AP, et al. Pituitary tumor transforming gene （PTTG） expression in pituitary adenomas[J]. J Clin Endocrin Metab, 1999,84（2）:761-767.
[8] Saez C, Japon MA, Ramos-Morales F, et al. hpttg is over-expressed in pituitary adenomas and other primary epithelial neoplasias[J].Oncogene, 1999,18（39）:5473-5476.
[9] Heaney AP, Singson R, McCabe CJ, et al. Expression of pituitary tumor-transforming gene in colorectal tumors[J]. Lancet, 2000,355（9205）:716-719.
[10] Chien W, Pei L. A novel binding factor facilitates nuclear translocation and transcriptional activation function of the pituitary tumor-transforming gene product[J]. J Biol Chem, 2000,275（25）:19422-19427.
[11] Pei L. Activation of mitogen-activated protein kinase cascade regulates pituitary tumor-transforming gene transactivation function[J]. J Biol Chem, 2000,275（40）:31191-31198.
[12] Ramos-Morales F, Dominguez A, Romero F, et al. Cell cycle regulated expression and phosphorylation of hPTTG proto-oncogene product[J]. Oncogene, 2000,19（3）:403-409.
[13] Chang SH, Liu CH, Conway R, et al. Role of prostaglandin E2-dependent angiogenic switch in cyclooxygenase-2-induced breast cancer progression[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,101（2）:591-596.
[14] Li G, Yan J. Cyclooxygenase-2 increased the angiogenic and metastatic potential of tumor cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2002,299（5）:886-890.
[15] Pockaj BA, Basu GD, Pathangey LB, et al. Reduced T-cell dendritic cell function is related to cyclooxygenase-2 overpression and prostaglandin E2 secretion in patients with breast cancer[J]. Ann Surg Oncol, 2004,11（3）:328-339.
[16] Brueggemeier RW, Quinn AL, Parrett ML, et al. Correlation of aromatase and cyclooxygenase gene expression in human breast cancer specimens[J]. Cancer Lett, 1999,140（1-2） :27-35.
[17] Chen G, Li J, Li F, et al. Inhibitory effects of anti-sense PTTG on malignant phonotype of human ovarian carinoma cell line SK-OV-3[J]. J Huazhong Univ Sci Technology Med Sci, 2004,24（4）:369-372.
