慢性乙型肝炎和肝硬化及肝癌与HLA-DQA1基因多态性关系的研究
作者：刘春涛 程宝泉 张宗利
【摘要】 目的：研究 HLA-DQA1 等位基因多态性与慢性乙型肝炎（HBV）病毒感染、肝硬化及肝癌的关系。方法：采用聚合酶链序列特异性引物（PCR-SSP）技术分别对 168 例慢性 HBV 感染者（包括 48 例慢性乙型肝炎、42 例乙型肝炎肝硬化和 78 例乙型肝炎后肝癌患者）以及 100 例对照（感染后自发恢复者）进行 HLA-DQA1 等位基因的检测。结果：慢性HBV感染者 HLA-DQA1*0102 的表型频率显著低于对照组（25.6% vs 47.0%, OR = 0.39，Pc=0.003 ），DQA1*0601表型频率高于对照组（4.2% vs 0, OR=0.96, P=0.039），但后者差异无统计学意义（Pc＞0.05）。肝硬化患者 DQA1*0104 的表型频率显著低于无肝硬化患者（6.4% vs 28.4%, OR=0.17, Pc=0.001），DQA1*0201 的表型频率高于无肝硬化患者（27.7% vs 12.2%, OR=2.76, P=0.014），但后者差异无统计学意义（Pc＞0.05）。HLA-DQA1 各等位基因的表型频率在肝癌患者与非肝癌患者间差异无统计学意义。结论：HLA-DQA1*0102 等位基因可能降低慢性HBV 感染的风险，而 DQA1*0104 等位基因可能降低乙型肝炎肝硬化的风险。乙型肝炎后肝癌的发生与HLA-DQA1 等位基因无明显相关性。
【关键词】 肝炎，乙型·肝肿瘤·HLA抗原
Association of HLA-DQA1 allele and chronic hepatitis B, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma
【ABSTRACT】 Objective: To investigate the association of HLA-DQA1 allele, chronic HBV infection, liver cirrhosis （LC）, and hepatocellular carcinoma （HCC）. Methods: The patients of 168
chronic HBV infection （including 48 chronic hepatitis B, 42 LC and 78 HCC patients） and 100 controls who had recovered from HBV infection were investigated for HLA-DQA1 typing by PCR/ SSP technique. Results: In chronic HBV infection patients, the phenotype frequency of DQA1*0102 was significantly decreased （25.6% vs 47.0%, OR = 0.39, Pc=0.003）, while DQA1*0601 was significantly increased （4.2% vs 0.0%, OR=0.96, P=0.039） compared with controls. The frequency of DQA1*0104 was significantly decreased （6.4% vs 28.4%, OR=0.17, Pc=0.001）, while DQA1*0201 was significantly increased （27.7% vs 12.2%, P = 0.014, OR = 2.76） in chronic HBV infection patients with LC compared to those without LC. But the differences of DQA1*0601 and DQA1*0201 failed to be significant after Bonferroni correction （Pc>0.05）. There was no significant difference in DQA1 alleles between chronic HBV infection patients with or without HCC （P>0.05）. Conclusion: HLA-DQA1*0102 and DQA1*0104 were associated with protection from chronic HBV infection and development of LC, respectively. There was no significant association between HLA-DQA1 and de
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是世界上最常见的感染之一， HBV感染后会出现不同的转归。人类白细胞抗原（human leucocyte antigen, HLA）基因复合体是首个被发现与疾病有明确关系的遗传系统，是决定宿主免疫反应状况的最重要的遗传因素。本研究采用聚合酶链反应序列特异性引物（PCR-SSP）技术对慢性HBV感染患者的HLA-DQA1基因多态性进行分析，从免疫遗传学角度探讨慢性HBV感染的发病机制及其临床转归。
1 材料与方法
1．1 临床资料 选取2006年2月～10月我院消化内科、普通外科及感染科门诊及住院患者进入研究，均为山东地区汉族人。慢性HBV感染组：包括48例慢性乙型肝炎、42例乙型肝炎肝硬化和78例乙型肝炎后肝癌患者，均按照2005年《慢性乙型肝炎防治指南》［1］中的诊断标准进行诊断和分类。肝硬化和肝癌患者均有组织学诊断依据（手术后病理或细针穿刺组织病理）。对照组：包括100例感染HBV 后恢复者，其HBV血清学标志为HBsAg（-） 、 抗-HBs（+） 和抗-HBc（+），排除其他系统性疾病。
1．2 基因组DNA提取 空腹静脉血5 ml，以2% EDTA抗凝，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，然后用酚/氯仿法提取DNA。
1．3 HLA-DQA1等位基因多态性的检测 采用 PCR-SSP技术测定HLA-DQA1等位基因多态性。按照Olerup等［2］的方法，针对DQA1设计16条序列特异性引物（包括9条5’端和7条3’端引物 ），组成 12对特异性引物对，可检测目前已知的所有DQA1 等位基因。PCR反应体系和条件参照［2］。PCR反应产物加样至含溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中，120 V电泳15 min，紫外透射下观察结果。
1．4 统计学处理 用SPSS13.0软件进行统计分析。两组间等位基因分布的差异用χ2检验或Fisher确切概率法，P≤0.05为差异有统计学意义，并用Bonferroni法校正P值（Pc），Pc＝P×等位基因的个数。
2 结果
2．1 HLA-DQA1等位基因表型频率比较 慢性 HBV感染组HLA-DQA1*0102的表型频率显著低于对照组（25.6% vs 47.0%, OR=0.39, P=0.000 3 ），经Bonferroni法矫正后，差异仍有统计学意义（Pc=0.003）；DQA1*0601 的表型频率显著高于对照组 （4.2% vs 0.0%, OR=0.96, P=0.039），但经矫正后差异无统计学意义（Pc均＞0.05 ）。
2．2 HLA-DQA1各等位基因表型频率比较 DQA1*0104 在肝硬化组中的表型频率显著低于无肝硬化组（6.4% vs 28.4%, OR=0.17, P=0.000 1），经 Bonferroni法矫正后，二者差异仍有统计学意义（Pc=0.001）；而肝硬化组DQA1*0201的表型频率则显著高于无肝硬化组（27.7% vs 12.2%, OR=2.76, P=0.014），但经矫正后差异无统计学意义（Pc＞0.05）。
肝癌组和无肝癌组HLA-DQA1各等位基因的表型频率差异均无统计学意义，P均＞0.05（图１）。
3 讨论
对HLA与HBV感染相关性的研究以往主要局限在HLA与HBV感染易感性之间的关系，本研究发现，慢性HBV感染者HLA-DQA1*0102的表型频率显著低于对照组（Pc=0.003），提示DQA1*0102可能降低慢性HBV感染的风险，与卢亮平等［3］对北方地区汉族人群的研究相一致。HLA-Ⅱ类分子通过其抗原递呈作用而在CD4+ T淋巴细胞介导的免疫反应中发挥关键作用，而HLA-DQ分子的大部分多态性序列位于 α-链的抗原结合位点，从而使 DQ 分子在免疫反应中发挥着独一无二的作用。以往的研究发现，携带DQA1*0302、DQA1*0201和DQA1*0501 等位基因可以增加发生慢性HBV感染的风险［3-5］，而携带DQA1*0301［6］则可以降低慢性HBV感染的风险。然而，我们的研究没有证实这些联系。这可能有以下原因：1）以往的研究样本量不够大；2）HLA等位基因的频率在不同种族之间有差异，在一个种族有阳性意义的等位基因可能在另一个种族没有统计学意义。
不同类型的HLA-Ⅱ类等位基因与不同病因导致的肝硬化相关联［７－９］。在本研究中，DQA1*0104在肝硬化患者中的表型频率显著低于无肝硬化患者（Pc=0.001 ），提示DQA1*0104等位基因对乙型肝炎肝硬化的发生具有抵抗作用。DQA1*0104分子可能对某些能导致纤维化的HBV抗原具有高亲和力，从而通过免疫反应对肝硬化的发生产生抑制作用。另一方面，HLA基因家族中很多基因之间呈连锁不平衡状态，故也可能是由与DQA1*0104紧密连锁的另一个未知的抗纤维化基因所介导的。
HLA可以影响机体对某些病原微生物所致恶性肿瘤的易感性［１０，１１］，特定HLA等位基因对病原微生物介导的恶性肿瘤的易感或抵抗作用可能是由于特定HLA分子作为抗原递呈者所产生的作用不同所致。HLA-Ⅱ类基因与乙型肝炎后肝癌的关系的研究已有两例来自香港的报道［１２］，但均未发现相关性。在本研究中，HLA-DQA1等位基因的表型频率在肝癌患者与无肝癌患者间差异均无统计学意义（P均＞0.05），表明DQA1等位基因可能不直接参与乙型肝炎后肝癌的发生。
本研究发现两个HLA-DQA1等位基因分别与慢性HBV感染及乙型肝炎肝硬化的进展相关，DQA1*0102可能降低慢性HBV感染的风险，而DQA1*0104等位基因则可能降低乙型肝炎肝硬化的风险。由于HLA基因家族中很多基因之间呈连锁不平衡状态，因此将来有必要对互相连锁的其他基因进行研究，进一步明确慢性HBV感染及其临床转归的免疫遗传学基础。
致谢：本研究是在山东大学部和卫生部心血管重构与功能研究重点实验室完成的，期间得到姜虹老师和冯进波老师的技术帮助，谨致谢意。
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