大蒜素对人结肠癌HT29细胞增殖影响及作用机制研究

             作者：王旭平　赵玲　王容   郭锋   辛华

【摘要】  　　目的：探讨大蒜素对体外培养结肠癌HT29细胞增殖的影响，并探讨其作用机制。方法：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定不同浓度大蒜素对HT29细胞增殖抑制率；流式细胞术测定细胞周期变化及凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax的表达。结果：MTT显示大蒜素能抑制人结肠癌HT29细胞的增殖，并具有时间-剂量依赖性；流式细胞术测定结果显示10 μg/ml大蒜素可明显诱导HT29细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在G2/M期；可降低癌基因蛋白Bcl表达，而促进Bax表达。结论：大蒜素对人结肠癌HT29细胞增殖具有抑制作用，可能与细胞周期阻滞和凋亡相关蛋白表达有关。

【关键词】  大蒜素　结肠癌细胞系T29　凋亡　流式细胞术

    【ABSTRACT】 Objective: To study the affection of Diallyl trisulfide on cultured human colon carcinoma cell line HT-29 and its mechanism. Methods: The viability of cells after various treatments were determined using the method of MTT. Flow cytometry were used to analyze the change of cell cycle and Bcl-2, Bax levels. Results: The proliferation of human colon carcinoma HT-29 cells were inhibited by Diallyl trisulfide. The inhibition was associated with dose and time dependence. Flow cytometry results showed that: 1） When cells were treated with Diallyl trisulfide at the concentration of 10 μg/mL for 12 h and 24 h, the percentage of G0/G1 phase cells was decreased and that of G2/M phase cells was significantly increased compared with those in the control group.2） Diallyl trisulfide down regulated Bcl expression, while up-regulated bax expression. Conclusions: It was suggested that Diallyl trisulfide inhibited HT29 cell proliferation. And these were associated with arrest of cell cycles and down regulation of Bcl2/Bax ratio.

    【KEY WORDS】 Diallyl trisulfide·Human colon carcinoma cell line HT-29·Apoptosis·Flow cytometry

    大蒜素是一种从大蒜鳞茎中分离出的具有多种生物学活性的化合物，其化学名为二烯丙基三硫化物。医学研究证实大蒜素具有抗菌、消炎、提高机体免疫力和抗肿瘤的作用［1-3］。体外研究显示,大蒜素可以通过诱导癌细胞（如胃癌、前列腺癌）生成活性氧（ROS），上调Bax，Bak和激活Caspase 3等方式促进其凋亡［1，4，5］，但大蒜素对结肠癌作用的研究较少。本研究以体外培养的结肠癌HT29细胞为材料，探讨大蒜素对结肠癌细胞增殖的影响并探讨其机制，以期为结肠癌的防治提供实验依据。

    1　材料与方法

    1.1　材料　人结肠癌HT29细胞由山东大学医学院细胞生物学研究所提供；大蒜素（二烯丙基代磺酸酯）为上海禾丰制药有限公司生产；MTT、二甲基亚砜（DMSO）、Ho33342、碘化丙啶（PI）为美国Sigma产品；DMEM、新生牛血清为美国Gibco产品；Bcl-2、Bax单克隆抗体购自美国BD公司。

    1.2　方法

    1.2.1　细胞培养　人结肠癌HT29细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液，于37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下静置培养。选择对数生长期细胞进行分组实验。

    1.2.2　MTT法检测大蒜素对细胞增殖的影响　细胞以5×104 ml-1的密度接种于96孔培养板中，培养48 h后，每孔加入不同浓度的大蒜素各100 μl ,终浓度分别为1、5、10、20 μg/ml，对照组加入含10%FBS的培养基，分别培养12、24、48 h后，分别向每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml）溶液，继续培养4 h，弃培养液，每孔加入DMSO 100 μl，脱色摇床振荡5 min；酶标仪检测（吸光度为570 nm）。每时间浓度组设3个复孔,实验重复3次。所得OD值根据公式细胞抑制率。细胞抑制率（%）=（1-OD实验组/OD正常组）×100%，以空白组OD值调零。

    1.2.3　大蒜素诱导结肠癌HT29细胞凋亡最适浓度筛选　以上各实验组加入大蒜素作用24 h，加入Ho33342（终浓度10 μg/ml）37 ℃温育20 min，再加入PI（终浓度50 μg/ml），荧光显微镜观察并记录图象。

    1.2.4　细胞形态学观察　10 μg/ml大蒜素分别作用0~24 h，每隔2 h倒置相差显微镜观察一次，随机选取视野记录图象。

    1.2.5　流式细胞仪检测大蒜素对细胞周期的影响 细胞以5×104ml-1接种于25 cm2培养瓶中, 培养48 h后，加入10 μg/ml大蒜素，分别培养12、24 h，弃培养液，加入0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min 离心8 min收集细胞。细胞用PBS 清洗3次后，500 μl PBS悬浮细胞，加入含10 μg/ml 的RNase的PI，4 ℃染色30 min。经200目滤网过滤后，上机检测。实验结果采用Modifit软件进行细胞周期各期的百分率及亚二倍体的百分率分析。实验重复3次。

    1.2.6　流式细胞仪检测大蒜素对Bcl-2和Bax的影响　细胞以5×104 ml-1接种于25 cm2培养瓶中, 培养48 h后，加入10 μg/ml大蒜素分别培养12和24 h，收集细胞，以 PBS 清洗3次，70%乙醇4℃固定1 h。经PBS再次清洗后，不同时间组细胞分别加入兔抗人Bcl-2或兔抗人Bax一抗，37℃孵育1 h，PBS清洗后加入FITC标记山羊抗兔二抗，37℃避光孵育20 min。阴性对照以PBS代替一抗。PBS洗3次后上流式细胞仪检测，实验重复3次。

    1.3　统计学处理　经SPSS11.0软件分析，组间比较采用方差分析，结果以x±s表示，α=0.05为显著性检验标准。

    2　结果

    2.1　大蒜素对结肠癌HT29细胞活性的影响　MTT结果显示1～10 μg/ml大蒜素均能抑制HT29细胞的增殖，呈时间-剂量依赖性；20 μg/ml大蒜素细胞毒性作用明显，作用12 h，细胞抑制率为74.73%，作用24 h以后细胞几乎全部死亡（表1）。

    2.2　大蒜素诱导结肠癌HT29细胞凋亡最适浓度的筛选　Ho33342和PI染色结果（图1）提示，各浓度组中，10 μg/ml大蒜素对HT29细胞诱导凋亡作用最明显；20 μg/ml大蒜素主要表现为细胞毒性作用。因此，本实验选取10 μg/ml作为最适诱导浓度来探讨其作用机制。

    2.3　细胞形态学观察　正常条件下HT29细胞呈梭形或多角形，传代培养48 h，细胞贴壁生长，有聚团现象；10 μg/ml大蒜素作用6 h，细胞开始出现形态学改变，紧贴瓶壁的细胞边界模糊，部分细胞缩起，分裂相减少；大蒜素作用12 h开始有凋亡小体出现；大蒜素作用24 h，大部分细胞回缩变圆，凋亡小体明显，部分细胞悬浮于培养基中，细胞碎片增多（图2）。

    2.4　大蒜素对细胞周期影响　流式细胞仪检测结果显示，10 μg/ml大蒜素作用12 h，HT29细胞凋亡率为16.72%；作用24 h细胞凋亡率为24.05%。细胞周期均发生了明显的变化，主要表现为G0/G1期细胞减少，G2/M期细胞增加，而S期细胞无明显变化（图3）。

    2.5　流式细胞仪检测Bcl-2和Bax表达　结果显示10 μg/ml大蒜素作用12和24 h，可降低癌基因蛋白Bcl-2表达，而促进Bax表达(表2)。

    3　讨论

    　　近年国内外流行病学调查发现,大蒜素对多种肿瘤有一定抑制作用[6],但具体机制尚未完全明确。本研究采用的大蒜素主要含三硫二丙烯,选择人结肠癌HT29细胞进行抑制增殖和诱导凋亡的研究，并初步探讨了其可能的作用机制。

    　　细胞周期在肿瘤细胞的生长调控中具有重要作用 ,通过改变细胞周期来阻止肿瘤细胞的增殖已受到人们的关注[7]。本研究发现，大蒜素作用后G1期HT29细胞明显减少，G2/M期相对增多。其原因可能是大蒜素抑制G2/M期, 使多数细胞不能通过M期向G1期的转变，导致G1期细胞减少, 使大量细胞停留在M期,无法完成正常的有丝分裂，提示大蒜素对HT29细胞有周期特异性抑制作用；大蒜素对HT29细胞 M 期的阻滞作用，对临床应用大蒜素防治结肠癌,尤其与周期特异性化疗药物辅助应用结肠癌具有重要的理论意义。

    　　Bcl-2家族在细胞凋亡中起着重要的作用，其家族成员包括抑制凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl等，促凋亡蛋白Bax、Bbad等。Bcl-2和Bax分别可以同源二聚体形式存在，二者之间也可以形成异源二聚体。Bax 的表达增多时，Bax-Bax 的同源二聚体便诱导细胞凋亡；而 Bcl-2 的表达增多时，Bax便和 Bcl-2 形成更为稳定的异源二聚体来抑制细胞凋亡。Bcl-2/Bax的比率可以调节细胞凋亡的速率[8]。本实验证明经大蒜素处理的HT29细胞，Bax表达升高而Bcl-2水平明显降低。提示大蒜素可能通过降低Bcl-2/Bax的比率诱导HT29细胞凋亡。

【】
  [1] Xiao D, Lew KL, Kim YA, et al. Diallyl trisulfide suppresses growth of PC-3 human prostate cancer xenograft in vivo in association with Bax and Bak induction[J]. Clin Cancer Res, 2006,12（22）:6836-6843.

[2] Li N, Guo R, Li W, et al. A proteomic investigation into a human gastric cancer cell line BGC823 treated with diallyl trisulfide[J]. Carcinogenesis, 2006 , 27（6）:1222-1231.

[3] Zhou Z, Tau HL, Xu BX, et al. Microarray analysis of altered gene expression in diallyl trisulfide-treated HepG2 cells[J]. Pharmacol Rep, 2005, 57（6）:818-823.

[4] Xiao XL, Peng J, Su Q, et al. Diallyl trisulfide induces apoptosis of human gastric cancer cell line MGC803 through caspase-3 pathway[J]. Ai Zheng, 2006,25（10）:1247-1251.

[5] Antosiewicz J, Herman-Antosiewicz A, Marynowski SW, et al. c-Jun NH（2）-terminal kinase signaling axis regulates diallyl trisulfide-induced generation of reactive oxygen species and cell cycle arrest in human prostate cancer cells[J]. Cancer Res, 2006, 66（10）:5379-5386.

[6] Fleischauer AT , Arab L. Garlic and cancer: a critical review of the epidemiologic literature[J]. J Nutr, 2001, 131（3s）:1032S-1040S.

[7] Alhasan SA, Ensley JF, Sarkar FH. Genistein elicits pleiotropic molecular effects on head and neck cancer cells[J]. Clin Cancer Res, 2001,7（12）:4174-4181.

[8] Ina K, Itoh J, Fukushima K, et al. Resistance of Crohn’s desease T cells to multiple apoptotic signals is associated with a bcl-2/Bax mucosal imbalance [J]. J Immunol, 1999,163（2）:1081-1090.