阻断B7/CD28共刺激通路抑制大鼠肝移植急性排斥反应的研究

          作者：刘钊　纪志鹏　刘毅　徐克森

【摘要】  　　 目的：建立大鼠原位肝移植（ROLT）急性排斥反应模型，观察细胞毒淋巴细胞抗原4免疫球蛋白（CTLA-4Ig）在大鼠肝移植术后对共刺激分子B7-1/B7-2的影响及其抗排斥反应的作用。方法：采用“二袖套管”法先行建立DA-Lewis大鼠组合肝移植急性排斥反应模型，随机分为对照组（A组）与实验组 （B组）两组，于肝移植术后48 h每只受体大鼠腹腔内一次性注射CTLA-4Ig 75 μg，分别于术后3、5、7和10 d采用RT-PCR检测B7-1和B7-2 mRNA在两组肝脏组织中的表达情况，并同时观察其肝功能变化。结果：1）B7-1和B7-2 mRNA在A组高水平表达，而在B组表达明显降低（P＜0.01）；2）B组动物术后未见明显排斥反应，血清ALT、TBIL和DBIL水平明显低于对照组（P＜0.01）。结论：移植术后应用CTLA-4Ig可以降低肝组织中B7-1和B7-2的表达；动态检测B7分子的表达有助于观察肝移植排斥反应的进程。

【关键词】  细胞毒淋巴细胞抗原4免疫球蛋白·共刺激分子·肝移植·排斥反应

　　 Preventing acute rejection after liver transplantation via blockading B7/CD28 costimulatory pathway in rats

    【ABSTRACT】 Objective:  To observe the effect of CTLA-4Ig on preventing acute rejection and the role of costimulatory molecule B7-1 and B7-2 via the model of orthotopic liver transplantation （ROLT） in rats. Methods: Build the model of ROLT （DA- Lewis）. All rats were divided into 2 groups randomly.Group A was control group. Group B was injected with CTLA4-Ig into abdominal cavity after 48 hours of operation. Animals were sacrificed on the day 3,5,7,10 after ROLT to detect

    the changes of serum biochemistry（ALT,TBIL and DBIL）.Liver grafts were collected for measuring the expression of B7-1 and B7-2 mRNA by RT-PCR.  Results: １）Compared with the control group, the expression of B7-1 and B7-2 mRNA increased significantly（P＜0.01）．２）In group B, no clinical rejection character were obserbed and serum biochemistry was lower than cortol group （P<0.01）.  Conclusion: CTLA-4Ig treatment can abate the expression of B7-1 and B7-2 mRNA. The dynami determination of costimulatory molecule B7 is helpful to the observation of rejection course in rats.

    【KEY WORDS】 Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 immunoglobulin G· Costimulatory molecule·Liver transplantation·Rejection 

    　　器官移植中排斥反应的发生依赖于T细胞的激活。近年研究发现，T细胞的激活依赖于抗原递呈细胞（antigen present cell，APC）提呈的双重信号，即特异性刺激信号和协同刺激信号，T细胞识别这两个信号，才能活化、增殖，发挥功能；若缺乏刺激信号，T细胞进入无反应状态或凋亡［1］。细胞毒淋巴细胞抗原4免疫球蛋白（cytotoxic T lymphocyte antigen-4 immunolobulin， CTLA-4Ig）是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）与IgG Fc段的基因重组融合蛋白，可阻断抗原特异性T细胞活化过程起重要作用的B7-CD28共刺激通路，从而导致这类T细胞的无能或凋亡，对控制器官移植排斥反应的发生具有重要作用［2］。本研究旨在利用CTLA-4Ig阻断B7-CD28通路，观察共刺激信号B7-1（CD80）和B7-2（CD86） mRNA在肝移植术后的表达情况，探讨B7分子与移植后排斥反应进程的关系。

    1　材料与方法

    1.1　材料　雄性近交系DA大鼠 48只，购于哈尔滨医科大学实验动物中心，体质量180～200 g；雄性近交系Lewis大鼠 48只，购于北京维通利华实验动物有限公司，体质量160~200 g；CTLA4-Ig购于BD Pharmingen公司； 纯化抗大鼠CD80单克隆抗体、纯化抗大鼠CD86单克隆抗体购自美国BioLegend公司；RT-PCR试剂盒购于TOYOBO公司。

    1.2　ROLT模型的建立及分组　采用“二袖套管”法，建立DA→Lewis 大鼠配对组合的 大鼠原位肝移植（orthotopic liver transplantation in rat，ROLT） 急性排斥反应模型，动物术前12 h禁食不禁水。凡ROLT术后存活48 h以上者纳入本研究，并按随机表法分为两组。A组为对照组（n=48）：DA→Lewis ROLT模型， 术后48 h腹腔内一次性注射生理盐水1 ml，未进行任何；B组为CTLA4-Ig组（n= 48 ）：DA→Lewis ROLT模型，于术后48 h腹腔内一次性注射CTLA4-Ig，75 μg/只。两组动物分别于移植术后3、5、7和10 d各随机选取6只处死，收集血清标本和肝脏标本。

    1.3　指标检测

    1.3.1　一般情况观察　观察两组受体鼠术后的精神状态、运动、食欲、耳廓和皮肤黄染程度以及小便颜色。

    1.3.2　肝功能测定　两组受体鼠分别于移植术后第3、5、7和10天剖腹经腹主动脉取血3~6 ml， 于低温离心机3 000 r/min 离心15 min， 取血清，分装后于-70 ℃冰箱保存备检。所有标本避免反复冻融，于检测前 2 h置于 2 ℃~8 ℃环境中解冻，所检测的肝功能指标有：谷丙转氨酶（ALT）、总胆红素（TBIL）和直接胆红素（DBIL）。

    1.3.3　B7-1和B7-2表达水平的测定　采用逆转录聚合酶链反应试剂盒检测肝组织中B7-1和B7-2 mRNA的表达。提取组织标本总RNA，以 β-肌动蛋白（β-actin）为内参，β-actin、B7-1和B7-2的引物序列参照Kojima的报道［3］，由上海鼎安科技有限公司合成。β-actin 上游引物为5’-ATGGARTCCTGTGGCATCCA-3’；下游引物为5’-CGCTCA-GGAGGAGCAATGAT-3’；扩增产物 224 bp。B7-1 上游引物为 5’-GGCATTGCTGTCCTGTGATTAC 3’；下游引物为 5’-ACTCAGTTATGTTGGGGG-TAGG -3’ ；扩增产物314 bp。B7-2 上游引物为5’-GCTCGTAGTATTTTGGCAGGACC-3’；下游引物为 5’-CGGGTATCCTTGCTTAGATGAGC -3’ ；扩增产物 337 bp。两步法RT-PCR反应检测 B7-1、B7-2 mRNA的表达。1%琼脂糖凝胶电泳，Alpha ImagerTM 2200凝胶成像系统观察电泳条带存入图像。以系统的SPOT DENSITY软件分别测量内参照和B7-1 和B7-2基因扩增条带的密度，以B7-1和B7-2条带的密度与内参照管家基因的密度比值代表基因表达的相对水平，作扩增产物半定量分析。

    1.4　统计学处理　应用SPSS13.0软件进行分析，计量资料以x±s表示，两组样本均数比较采用t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

    2　结果

    2.1　两组动物的一般情况　A组动物于术后3～4 d起开始出现体重减轻，皮肤、耳廓黄染逐渐加深，行动迟缓，尿色深黄，7 d以后精神明显萎靡，消瘦，毛发蓬乱、脱落；术后7~14 d内出现死亡。尸检发现，肝脏脾脏肿胀严重，腹腔内腹水不明显，套管及胆道支撑管无脱落、扭曲，无腹腔内出血等手术操作失误致死因素。B组动物术后7 d内亦表现为精神较差，体质量减轻，但尿色清亮，无明显皮肤、耳廓黄染；7 d以后精神食欲逐渐恢复正常，体重逐渐增加。

    2.2　血清ALT、TBIL和DBIL测定结果　两组大鼠于术后3、5、7和10 d检测血清ALT、TBIL和DBIL指标，A组肝功能损伤明显，B组肝功指标各时相点之间变化不明显， 3项指标水平均明显低于A组，P<0.05（表1）。      

    2.3　PT-PCR检测肝组织B7分子mRNA的表达　 B7-1 mRNA和B7-2 mRNA在B组低表达，而在A组明显表达，P＜0.01。各组间观察，可见B7-1 mRNA和B7-2 mRNA表达随时间的延长、肝移植排斥反应的进展而逐渐增强（表2，图1～3）。

    3　讨论 

    　　活化的T淋巴细胞在宿主抗肿瘤、抗感染、以及自身免疫性疾病方面起着重要作用。T细胞活化的双信号学说认为，抗原特异性T细胞活化需要的两个不同信号，第一信号来自抗原特异性T细胞受体（TCR）与抗原肽-MHC（主要组织相容性复合体）分子复合物相互作用，第二信号来自APC上的B7家族分子与其在T细胞上的配体CD28家族分子相结合产生的协同刺激信号［１，4］。B7-CD28 是迄今为止公认的最基本的协同刺激信号，由表达在T 细胞上的CD28 和表达在抗原递呈细胞表面的B7-1和B7-2相互作用产生的共刺激信号［5］。所有B7分子和它们的受体都是Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。B7家族各成员之间有 20%~35% 氨基酸序列是相同的。

    　　CTLA-4作为识别Ｂ7家族成员的抑制性受体，和CD28同属免疫球蛋白超基因家族，具有70%的共同氨基酸序列，均为表达于T细胞表面的跨膜受体，其天然配体均为存在于APC表面的B7分子家族，包括B7-1，B7-2和B7-3；但二者介导的免疫效应不同，CTLA-4同B7-1、B7-2的亲和力比CD28强10~100倍［6］。研究表明CD28与B7-1、B7-2结合，起增强或放大免疫应答的作用；而CTLA-4与B7-1、B7-2结合，可以阻断CD28与其结合，阻断共刺激信号的传递，抑制Ｔ细胞的活化增殖［２，７］。CTLA-4对T细胞活化发挥的关键性负调控作用，已被CTLA-4缺陷性小鼠的表型强有力的加以证实，此类小鼠在出生后3～4周就因重要脏器广泛的淋巴细胞浸润和组织损伤而死亡［8］。

    　　本研究发现，CTLA4-Ig组大鼠术后未见明显排斥反应，可健康存活，移植肝形态、大小和色泽均与正常鼠无明显差异；肝功能3种指标的浓度均维持在较低水平，明显低于对照组，两组间差异具有统计学意义（P＜0.01），说明CTLA-4Ig组肝细胞损伤减轻，未发生急性排斥反应。共刺激分子B7-1、B7-2的增高是T细胞活化的必备条件之一，主要以单体形式表达于APC上，未经抗原刺激的APC几乎不表达B7分子，一旦受到抗原刺激后，B7分子大量表达于活化的B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核巨噬细胞和树突状细胞表面，即具备了共刺激信号。B7与CD28传递兴奋信号，增加IL-2 mRNA的转录，使IL-2分泌增加，T细胞大量增殖活化，促使Th1和Th2细胞因子的产生［9］，进一步诱导B淋巴细胞、单核巨噬细胞等的活化，并降低了抑制性T淋巴细胞通过辅助性T淋巴细胞引发的抗原递呈细胞表面B7分子表达上调的抑制，从而增加B7分子的表达。本研究应用CTLA-4Ig与APC上B7分子结合，阻断B7-CD28共刺激通路，阻断共刺激信号的传递，通过抑制细胞因子IL-2的合成和IL-2R的表达及使细胞阻滞于G1期来抑制Ｔ细胞的活化增殖［6］，抑制细胞因子的产生，从而减少B淋巴细胞、单核巨噬细胞的活化，降低共刺激分子B7-1、B7-2的表达。本研究结果显示，CTLA-4Ig组大鼠肝脏组织内B7-1、B7-2 mRNA表达较对照组明显减低，表明应用CTLA-4Ig可以抑制共刺激分子B7-1、B7-2表达，抑制Ｔ细胞的活化增殖。CTLA4-Ig具有明显、确切的免疫抑制作用［１０］。

    　　本研究参照人类肝移植排斥反应诊断标准进行ROLT术后排斥反应的判断，以上结果显示，对照组大鼠术后出现排斥反应症状，血清生化指标升高，B7分子表达水平显著高于CTLA4-Ig组，且可排除感染因素的干扰（术后取材未发现有明显的感染征象）。该结果提示，肝移植术后发生排斥反应时B7分子的表达可明显升高，肝组织中B7分子的表达与排斥反应的进程有关，随着时间延长，移植物排斥反应逐渐升级；而CTLA4-Ig有抑制B7分子表达的作用，即具有抗排斥作用。B7分子是否可作为诊断肝移植术后排斥反应的标准，有进一步研究的价值。

【】
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